色谱法本科生教学中

1、1,生物化学实验教学,2,实验内容：,1.生物化学常用四大技术（分光光度法血糖测定，蛋白定量分析；色谱法离子交换色谱和凝胶色谱；电泳法醋酸纤维薄膜电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳；离心质粒DNA的小量快速制备中使用） 2.GPT酶活性测定 3.过氧化氢酶Km值测定 4.酶竞争性抑制 5.实验操作考试 6.课堂讨论及课堂答疑,3,色谱法,4,第一节 概述,色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法

2、（chromatography)。又称层析法。,5,第一节 概述,石油醚（流动相M）,碳酸钙（固定相S）,玻璃管（色谱柱）,胡萝卜素、叶黄素 和叶绿素A、B,连续色带 （色谱）,植物叶子的石油醚萃取液,6,第一节 概述,在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相 ；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相 ；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱 。,7,第一节 概述,当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短

3、不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。,8,第一节 概述,色谱法是利用混合物中各组分的理化性质的差异（吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等），使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相叫固定相（stationary phase），另一相流过此固定相叫做流动相（mobile phase）。由于各组分受流动相作用产生的推力和受固定相作用产生的阻力的不同，使各组分产生不同的移动速度，从而使结构上只有微小差异的各组分得到分离。,9,第一节 概述,特点： 1具有极高的分辨效力：同系物、同分异构体，甚至同位素。 2具有极高的分析效率：HPLC(high performance th

4、in layer liquid chromatography)一次仅10分钟就可完成40个样品的点样和分析工作。 3具有极高灵敏度：样品组分含量仅数微克，或不足一个微克都可进行很好的分析。 4操作简便，应用广泛：,10,第一节 概述,从不同角度，可将色谱法分类如下： 1.按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC） 根据固定相是固体吸附剂还是固定液又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）。,11,第一节 概述,液体为流动相的色谱称液相色谱（LC） 同理液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）。,12,第一节 概述,2. 按分离机理分类 利用组分在吸附剂（固定相）上

5、的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。 利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。 利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。,13,第一节 概述,利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。 将具有生物学活性（如酶、辅酶、抗体等）的配位基，键合到载体或基质表面形成固定相。利用蛋白质或生物大分子与亲和色谱固定相配位基的亲和力进行分离的色谱法，称为亲和色谱法。,14,第一节 概述,3. 按操作形式不同分类 柱色谱法：固定相装于柱内的色谱法。 平面色谱法：色谱过程在

6、固定相构成的平面层内进行的色谱法，包括纸色谱法、薄层色谱法和薄膜色谱法。,15,第二节 常用的色谱方法,16,（一）基本原理： 利用不同的生物大分子的带电部分与 具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱不同，经过强弱不同的洗脱剂进行洗脱从而达到分离目的。,一、离子交换色谱（ion exchange chromatography）,17,离子交换剂： 藉酯化、氧化或醚化等化学反应在琼脂糖、纤维素或凝胶分子上引入阳离子或阴离子基团的特殊剂型。当离子交换剂带阳离子基团时，可吸附阴离子样品称为阴离子交换剂，如DEAE。反之，离子交换剂带阴离子基团时，可吸附阳离子样品称之为阳离子交换剂，如CM。,一、离子交换色

7、谱（ion exchange chromatography）,18,一、离子交换色谱（ion exchange chromatography）,阳离子交换剂分子中具有酸性基团，能和流动相中的阳离子进行交换。例： RSO3H+ + Na+RS O3 Na+ + H+ 阴离子交换剂分子中具有碱性基团，能和流动相中的阴离子进行交换。如： RNH4 OH+ClRNH4+ Cl+OH,19,Ion exchanger,An ion exchanger consists of an insoluble matrix to which charged groups have been covalently

8、bound, the charged groups are associated with the mobile counter-ions (反离子). These counter-ions can be reversibly exchanged with other ions of the same charge without altering the matrix. There are two kinds of ion exchangers.,20,Cation exchanger (阳离子交换剂),Cation exchangers have positively charged co

9、unter-ions which can be exchanged with the cations in the mobile phase. RSO3H+ + Na+RS O3 Na+ + H+,+,+,+,+,+,counter-ions,21,Anion exchanger (阴离子交换剂),Anion exchangers have negetively charged counter-ions which can be exchanged with the anions in the mobile phase. RNH4 OH + ClRNH4f+ Cl + OH,+ + + + +

10、 +,counter ions,22,一、离子交换色谱（ion exchange chromatography）,分离样品时，主要依靠增加流动相的离子强度或改变酸碱度来进行洗脱。 增加流动相的离子强度：当缓冲液的离子强度增加时，即增加了它与生物大分子对交换基团竞争吸附的能力，把生物大分子置换下来。 改变酸碱度：当缓冲液的pH接近生物大分子的等电点时，其净电荷为零，从而可被洗脱。,23,一、离子交换色谱（ion exchange chromatography）,（二）离子交换剂的类型： 主要有离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换琼脂糖和离子交换葡聚糖。常用的离子交换基团有:二乙基氨基乙基（DE

11、AE）、羧甲基（CM）、磺酸基等。,24,一、离子交换色谱（ion exchange chromatography）,（三）洗脱方式： （1）分步洗脱法：选用几种洗脱能力逐步增强的洗脱液相继洗脱，适用于各组分对交换剂亲和力比较悬殊的样品。 （2）连续梯度洗脱法：选用离子强度和pH呈连续梯度变动的洗脱液进行洗脱，使洗脱能力持续增强，适用于各组分与交换剂亲和力相近的样品。,25,（四）具体实验应用：,实验五 氨基酸的离子交换柱色谱分离,26,1实验原理:,离子交换剂：磺酸型阳离子交换树脂（732型） 分离的氨基酸：天冬氨酸（Asp pI=2.97）和赖氨酸 （Lys pI=9.74）的混合液。 洗

12、脱方式：改变洗脱液的pH值 在pH=5.3条件下，Lys解离成阳离子挂在树脂上；Asp解离成阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱。 在pH=12条件下，Lys解离为阴离子从树脂上被交换下来。,27,阳离子交换色谱原理示意图,.,.,28,2操作步骤：,（1）树脂的处理（2）装柱（已作好） （3）平衡（检查色谱柱有无裂痕和气 泡），调流速（10-12滴/分钟） （4）加样和洗脱（示教） （5）收集3管（一加样就开始收集，每管 3ml） （6）改换高pH洗脱液收集4-10管,29,2操作步骤：,（7）测定（收集管按顺序编号，每管取0.5ml于另一试管，加入1ml pH=5.3洗脱液、0.5ml茚

13、三酮溶液，100oC水浴25min，水冷却5-10min，加入60%乙醇3ml，摇匀，722型分光光度计比色，波长为570nm，空白对照管为柠檬酸洗脱液1.5ml，茚三酮0.5ml,乙醇3ml）,绘制洗脱曲线 （8）色谱柱再生（用pH=5.3洗脱液平衡）。,722S型分光光度计的使用方法（吸光度的测定）： 1. 开机预热15min以上。 2. 转动波长选择钮，选用所需的波长。 3. 将装有空白、标准、样品的比色杯放入比色杯架，使空白管对准光路。 4. 打开样品室暗箱盖（光门自动关闭），按0%ADJ 键，即能自动进行机械零点的调整，数码显示为0.000。 5. 盖好比色杯暗箱盖（光门自动开启），

14、按100%ADJ 键，即能自动进行空白零点的调整，数码显示为100.0。（一次如有误差可再按一次） 6. 按MODE 键选择吸光度测定模式（ABS灯亮），数码显示自动转换为吸光度值0.000。 7. 拉动比色杯架的拉杆，使测定杯进入光路，从数码显示上即可读出样品的吸光度 8. 比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色杯暗箱盖好，清洗比色杯并晾干。,31,二、凝胶色谱（gel chromatography）,（一）基本原理： 凝胶色谱是指混合物随流动相流经装有凝胶作固定相的色谱柱时，混合物中各种物质因分子大小不同而被分离的技术。,32,二、凝胶色谱（gel chromatography）,凝

15、胶：是指一类具有三维空间多孔网状结构物质，凝胶颗粒直径一般在0.1-1mm之间。 色谱过程与过滤相似，故又名凝胶过滤，其机理是分子筛效应。在洗脱过程中，分子大小不一的物质同时加入凝胶床，大分子因直径大于凝胶网孔，在凝胶颗粒间隙流动，阻滞小，流程短，先流出色谱柱；小分子因直径小于网状结构的孔径而进入凝胶颗粒内部，受阻滞作用大，流程长，移动速度慢，后流出色谱柱。,34,（二）凝胶种类,1交联葡聚糖凝胶（Sephadex / Dextran）：是由葡聚糖（右旋糖苷）和甘油通过醚桥相交联而成。 2聚丙烯酰胺凝胶： 3琼脂糖凝胶： 4Superdex凝胶：,35,（三）特点,1洗脱条件温和，不会引起物质变性失活。 2洗脱过程中不需改变洗脱液成分和种类，凝胶柱可反复使用。 3实验具有高度的重复性 ，回收样品几乎可达100%，既可用于大样品制备，也可用于小样品分析。,36,（四）应用：,作为脱盐工具、高分子溶液的浓缩、用于 去除热源物质、用于测定高分子物质的分 子量、用于物质的分离提纯。,37,（五）实验举例,血红蛋白与核黄素的 凝胶柱色谱分离,38,