样本DNA提取、纯化、保存方法.ppt

1、样品DNA提取，纯化，保存方法，1 .DNA种类：真核生物DNA、细菌DNA、病毒DNA、质粒DNA细胞显液DNA、组织DNA、双链环、双链线、单链环核DNA 2。核酸样品中不应有抑制酶的有机溶剂和高浓度金属离子。其他生物大分子(如蛋白质、多糖、脂肪分子)的污染必须最小化。其他核酸分子，例如RNA，也应该尽可能地去除。3 .准备DNA样本，1 .生物组织：最好的新鲜组织，如果不能马上提取，70或液氮，液氮冷冻粉碎组织调平方法液氮调平方法，2。细胞培养，悬浮生长细胞：1500g离心，410分钟细胞收集血液抗凝剂，柠檬酸抗凝液(ACD):柠檬酸0.48g柠檬酸钠1.32g右葡萄糖1.47g H2O

2、 100ml每6ml新鲜血液1ml ACD液，保存0保存几天，-70器官，4 .DNA提取，1 .苯酚提取：首先用蛋白酶K，SDS打碎细胞，消化蛋白质，然后用苯酚和苯酚-氯仿提取乙醇，使乙醇沉淀。DNA大小为100150kb、2。甲基酰胺解集法：破裂的细胞如上。然后用高浓度的甲基酰胺解除蛋白质和DNA的结合，透析，获得DNA。你可以得到大约200kb的DNA。3 .玻璃棒缠绕法：用盐酸胍分解细胞，在乙醇上铺上分解物，用钩子或U型玻璃棒在界面上轻轻搅拌，DAN沉淀液在波巴周围搅拌。(大卫亚设，美国电视电视剧)，玻璃棒，玻璃棒，玻璃棒约80kb的DNA。4 .异丙醇沉淀法：基本上，用1等方法代替乙

3、醇，只使用两倍的容积异丙醇，就可以去除小分子RNA(在异丙醇中溶解的状态)。5 .表面活性剂快速制备方法：用Triton X-100或NP40表面活性剂粉碎细胞，然后用蛋白质K或苯酚去除蛋白质、乙醇沉淀或透析。6 .加热法快速准备：加热法快速准备：加热96100，5分钟，离心后可用于青青，PCR反应。7 .碱变性的快速制备：首先用NaOH作用20分钟，然后添加HCl中和，离心后清浊，含有少量DNA。5，富集DNA，1。固体聚乙烯乙二醇(PEG)富集，2 .丁醇萃取富集：在DNA溶液中，水可以分配给正丁醇或2-丁烷醇，但DNA不是。因此，重复多次可以大大减少DNA体积。3 .乙醇或异丙醇沉淀：(

4、1)需要阳离子盐的存在NaAc最常用，NaCl含有SDS样品，NH4Ac去除dNTP，LiCl沉淀RNA，但不能在逆转录前使用。(2)沉淀温度和时间0，1015分钟。(3)离心04，12000G，10分钟，比100bp DNA小的超速离心，4，丁胺沉淀法和DNA相结合后，使DNA结构凝结沉淀需要无盐或低盐溶液。6 .DNA鉴定，1 .分光光度法，260nm和280nm中DNA溶液的光吸收测定，A260和A280的比率应为1.751.80。低于牙齿值的话，表示准备物中还剩下蛋白质成分或苯酚。高于牙齿值表明存在RNA残留。2 .凝胶传记游泳分析，(1)。影响琼脂糖凝胶DNA迁移率的因素，A，DNA

5、的分子大小分子越大，迁移速度越慢，B，琼脂糖浓度迁移率与浓度成反比的琼脂糖含量(W/V)线性DNA分离范围(KB) 0.3 5-60.6 1-20 0 0.7 0.8切口环(类型)和线性(类型)DNA以不同的速度通过凝胶，通常移动率类型，D，电压移动率与添加的电压成正比，但过大而有效的分离范围变小。2Kb DNA，电压5V/cm。E，电场方向单方向速度相同，改变方向，大分子DNA移动速度较慢。用脉冲电场凝胶传记电泳分离最大DNA。(2)。DNA检查，A，溴B染色，在254nm紫外线下检测，如果需要回收，最好在300nm紫外线下剪切粘合剂。否则，很容易去掉脱皮，切断链条。1厘米宽带能检测到10n

6、g DNA。b、银染色法、Ag和DNA形成复合物，可以在甲醛还原中染成黑棕色，灵敏度高200倍，但不能回收利用。(3)。分析，一般和已知分子量的标准DNA片段一起传记电泳，就能知道DNA样本的大小。如果绳子拖着尾巴，DNA放得太多，或者凝胶做得不好。分子量小或块状的东西意味着DNA被分解了。目的为了判断DNA片段的大小，在同一凝胶的目的DNA旁边添加分子量参考物的情况较多，传记游泳和染色的话，可以在紫外线灯下快速了解目的片段的大小。最常用的分子质量参考是Hind消化物，每个段的大小均以BP表示，分别为23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125。(4)。DNA回收，A，从传记影洞到DEAE-纤维膜，在所需带前插入DEAT-纤维膜，从继续传记影洞到带DNA，都到膜上取出。B，透析袋电将把切断绳子的琼脂糖凝胶冲洗掉，放入透析台内，加入缓冲液后，传记永冻，DNA出胶后回收。、C，低熔点琼脂糖凝胶切割胶，用65熔融胶加热，然后用苯酚萃取回收DNA。7 .DNA的定量，1 .分光光度法：测定A260nm中DNA的光吸收，计算浓度A260稀释倍数50 g/ml(双链DNA) A260稀释倍数40 g/ml(单链DNA)。3 .微凝胶传记电泳：样