细胞衰老与凋亡

1、第十三章,细胞衰老与凋亡,第一节细胞的衰老,“生、老、病、死”是生命的四重奏。生物机体内大多数细胞都要经历未分化分化衰老死亡的历程。因此, 细胞总体的衰老反应了机体的衰老, 而机体的衰老是以总体细胞的衰老为基础的。 衰老(aging) ：通常将机体的形态、结构和生理功能逐渐衰退的总现象称为衰老，是不可逆的生命过程。生物体是由细胞组织起来的，组成细胞的化学物质在运动中不断受到内外环境的影响而发生损伤，造成功能退行性下降而老化。 细胞衰老是细胞生命活动的客观规律。对多细胞生物而言, 细胞的衰老和死亡与机体的衰老和死亡是两个不同的概念, 机体的衰老并不等于所有细胞的衰老, 但是细胞的衰老又是同机体的

2、衰老紧密相关的。 细胞的衰老与死亡是新陈代谢的自然现象。衰老过程发生在生物界的整体水平、种群水平、个体水平、细胞水平以及分子水平等不同的层次。,细胞也同生物体一样，有一定的寿命，体内总有细胞不断地衰老与死亡, 同时又有细胞的增殖与新生进行补充。 不仅在胚胎发育过程中，在成年体内的各组织器官中也有细胞的死亡。 各类细胞本身的寿命很不一样。 能够保持持续分裂能力的细胞是不容易衰老的。分化程度高又不分裂的细胞寿命却是有限的。,一、细胞的寿限,Hayflick界限(Hayflick life span),1961年，Hayflick 和 Moorhead报道，体外培养的人二倍体细胞表现出明显的衰老、退

3、化、和死亡的过程。 若将细胞数以1：2的比例（即一瓶细胞分为两瓶细胞）连续进行传代，则平均只能传4660代，此后细胞逐渐解体并死亡。 细胞，至少是培养的细胞，不是不死的，而是有一定的寿命的；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是著名的Hayflick界限。,体外培养的年轻和老的人成纤维细胞的显微形态 左边是只分裂了几代的年轻成纤维细胞，呈现薄层、细长的形态； 右边是分离了50次的衰老的成纤维细胞，开始衰退，并很快死亡。,Hayflick等发现，动物体细胞在体外可传代的次数，与物种的寿命有关。,表 细胞的寿命与物种的寿命的关系 物种 寿命（年） 培养细胞传代次数 小鼠 3 12 鸡

4、30 25 龟 200 140,物种的寿命与体外培养时细胞传代次数的关系,二、细胞衰老的特征-形态和生理生化,细胞水分的减少 , 导致细胞脱水收缩，体积变小。 这是由于构成蛋白质亲水胶体系统的胶粒脱水时间或其他因素的影响， 逐渐失去电荷而互相合并，胶体失水，胶粒的分散度降低，不溶性蛋白 质增多，导致细胞硬度增加，代谢速率减慢而趋于老化。,色素颗粒沉积增多 脂褐素(老年色素)，主要成分是不溶性的脂蛋白颗粒，蜡样质，光镜下呈黄褐色的圆拱形或椭圆形颗粒。 脂褐素在胞浆中沉积随老年化过程而逐渐增加，在分裂能力低或不分裂的细胞，如肝细胞、基细胞和神经细胞中的积聚更为明显。在人和大鼠的脑皮层和海马中脂褐素

5、的积累是衰老的常见形态之一。 脂褐素的沉积引起细胞质结构和比例的异常，如细胞中线粒体数目和粗面内质网数目减少，以及细胞质的空泡形成等。,Werners syndrome（一种早老症）,3. 细胞器的衰老变化 （1）细胞膜上的微绒毛数目增加； （2）细胞膜的流动性降低； （3）细胞膜受体配体复合物形成效能降低； （4）细胞中线粒体的数量随着年龄的增大而减少，而其体积则随着年龄的增大而增大。线粒体是细胞衰老的生物钟。 （5）核结构在衰老过程中最明显的是核膜内折，并随年龄增长而增加，最后导致核膜崩解。另外还有染色质固缩、核仁和核内骨架成分的变化等。,4.化学组成与生化反应的改变 （1）蛋白质合成的速

6、度下降； （2）细胞内酶的活性与含量有所改变。,表 细胞衰老的形态变化,尼氏体为嗜碱性物质，又称嗜染质，光镜下呈斑块状或细粒状散在分布。在一些大型的运动神经元，尼氏体大而多，宛如虎皮花纹，又称“虎斑”电镜下，尼氏体由大量平行排列的粗面内质网和其间的游离核糖体组成。,Plant Cell senescence,植物的细胞衰老是植物组织、器官和个体衰老的基础，主要包括细胞膜衰老和细胞器衰老。,1) 膜脂相变衰老早期发生的事件。幼嫩细胞的膜为液晶相，流动性大。在衰老过程中，生物膜由液晶相向凝固相转化，结果膜变得刚硬，流动性降低，粘滞性增加。,2）膜脂的降解和过氧化，膜磷脂含量下降 磷脂生物合成减少，

7、磷脂酶活性增加造成。在磷脂酶(phospholipase)、脂氧合酶(lipoxygenase)和活性氧的作用下发生膜脂的过氧化。 3）膜的完整性丧失导致膜渗漏 细胞内外离子等梯度失去平衡，导致代谢紊乱。,4） 核糖体和粗糙型内质网的数量减少叶绿体类囊体解体线粒体嵴扭曲，褶皱膨胀液泡膜破裂，使细胞发生自溶，加速细胞的衰老解体。,1.DNA：复制与转录受阻，端粒DNA、mtDNA缺失。 DNA氧化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低。 2. RNA：含量降低。 3.蛋白质：含量下降，发生修饰、交联。 4. 酶分子：活性中心被氧化，金属离子丢失，酶分子的二级结构，溶解度，等电点发生改变，酶失活。 5

8、.脂类：不饱和脂肪酸被氧化。,（二）细胞衰老分子水平的变化,（一）差错学派 1、代谢废物积累：如：脂褐质 2、自由基攻击：导致DNA、蛋白质变异，正常细胞内存在清除自由基的防御系统，细胞衰老时清除自由基能力下降。 酶系统：超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)； 非酶系统：VE，VC，谷胱甘肽，醌类等电子受体。,三、细胞衰老的分子机理,内、外信号感受与传导基因调控生理生化变化衰老 衰老的机制（引起衰老的原因）？ 虽然衰老的理论很多，但归纳起来主要分为两类：一类是基因程序论，另一类是损伤积累论。,随着年龄增长，细胞合成蛋白质的能力下降，也包括SOD和C

9、AT合成数量的减少或合成了没有功能的SOD和CAT，自由基和H2O2就会积累，并且对细胞的蛋白质、DNA、细胞膜等进行攻击破坏，细胞在自由基的攻击下会导致死亡，就会在老人的皮肤上见到老年斑(age spots)，它是自由基对细胞破坏的见证。,老人斑：自由基攻击细胞的见证,3、衰老的损伤积累理论,由于细胞的修复和维持总是少于无限存活细胞的需求而出现的损伤积累。损伤的积累可以通过细胞成分的磨损和撕裂的方式或合成错误的方式出现。这些错误包括DNA复制错误、蛋白质合成错误。 最有代表性的理论是错误成灾理论。它是指细胞大分子合成错误成灾。 细胞里的核酸和蛋白质在生物合成中如果由于某些原因发生差错, 当变

10、质的非功能蛋白达到一定水平时，出现完全丧失功能的“错误灾难”。 1963年，Orgel 提出差误理论认为，在信息转移的各个步骤(如转录和翻译)中发生的差误，可以造成有缺陷蛋白的积累。当误差的产生超过某一阈值时，引起机能失常，出现衰老和死亡。 这种差误包括在转录过程中将错误核苷酸掺入mRNA或在翻译时将错误氨基酸掺入蛋白质，形成氨基酸错误的无功能酶。Nakagawa等1980年曾在大豆中发现这类酶。,1、细胞有限分裂学说 “Hayflick”极限，即细胞最大分裂次数。 L.Hayflick (1961)报道，人的成纤维细胞在体外培养时增殖次数是有限的（6070代）。 细胞增殖次数与端粒DNA长度

11、有关。Harley等发现人体内成纤维细胞端粒每年约缩短1418bp，而外周血淋巴细胞则每年缩短33bp。 2、重复基因失活学说：哺乳动物rRNA基因数随年龄而减少。,（二）遗传论学派,3、衰老基因学说 子女的寿命与双亲的寿命有关； 各种动物都有相当恒定的平均寿命和最高寿命； 成人早衰症：平均39岁时出现衰老，47岁生命结束； 婴幼儿早衰症：1岁时出现明显的衰老，1218岁生命结束， 早衰症患者体内解旋酶发生突变 。 Caenrhabditis elegans的平均寿命仅3.5天，该虫age-1单基因突变，可提高平均寿命65%，提高最大寿命110%。,Hutchinson-Gilford syn

12、drome早老症,营养亏缺理论：生殖器官消耗和积累大量营养物质，致使其它器官（营养体）因营养缺乏而衰老死亡。 证据：番茄根尖组培及不断摘除花。龙舌兰不开花-生活几十年，开花-8-10年。 相反证据：向日葵在雄蕊分化前根系已开始衰老；玉米、辣椒摘除花反而加速衰老；菠菜雄株随开花衰老。,激素调控理论：衰老是由于植物体或器官内各种激素平衡改变的结 果。延缓衰老的激素CTK、IAA、GA不足或促进衰老的激素ABA、Eth 占优势均可引起衰老。,自由基假说（Harman,1965提出）：植物体内产生的自由基会损 伤核酸、蛋白质和生物膜，从而导致细胞器的破坏和细胞的解体；但同时 体内具有一套精致的抗氧化保

13、护系统（SOD、CAT、 GSH-PX）来消除自 由基的危害。正常情况下，体内自由基的产生与消除之间处于动态平衡， 生命活动正常进行。一旦由于内外因素打破这种平衡，自由基的危害不能 控制，就会引起衰老。,植物细胞衰老的理论,Senescence-associated genes (SAGs) expression 衰老是一个遗传基因控制的渐进过程，因为不同的植物种类寿命差异很大。新近的研究发现在细胞衰老期间，基因的表达大致可为2类： 一类是衰老下调(downward)基因，这些大都是与光合作用及其他合成和产能有关的酶的基因。 另一类是衰老上调(upward)基因，这些多是水解酶的合成基因。如：

14、DNase，RNase， Protease, phospholipase 。,如玉米、拟南芥和油菜中的蛋白降解酶基因SAG2, See1, LSC7，SAG12，LSC790，LSC760等； 拟南芥中克隆的核酸降解基因RNS1，RNS2，RNS3； 油菜、玉米、黄瓜中脂降解与糖衍生有关基因PEPC，MDH，MS，ICL，GAPDH和F-1，6-2P醛缩酶基因， 拟南芥、萝卜、水稻、石刁柏中与碳和N元素再动员有关的-半乳糖苷酶基因。,SAGs指这些基因的mRNA水平随衰老而提高，它们通常是与细胞内大分子物质降解和搬运等代谢过程有关的基因。,把SAG12的启动子与IPT的编码区连接后形成嵌合基因

15、PSAG12-IPT，一旦衰老，SAG12启动子将激活IPT的表达，细胞分裂素含量上升，叶片的衰老延缓；衰老进程受阻后，对衰老敏感的SAG12启动子将关闭，从而有效地阻止了细胞分裂素的过量表达。,IPT：编码异戊烯基转移酶,（三） 程序性细胞死亡理论,程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)：指在一定的生理或病理条件下，细胞遵循自身的“程序”，主动结束其生命的过程，又称细胞凋亡(apoptosis)。 PCD是相关基因程序性活动的结果。 如叶片衰老，是在核基因控制下，细胞结构有序解体和内含物降解以及矿质和有机物有序地向非衰老细胞转移和循环利用的过程。,第二节 细胞

16、死亡,死亡是生命的普遍现象，但细胞死亡并非与机体死亡同步。 正常的组织中也发生细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。,一、细胞死亡的方式1、细胞坏死 是细胞受到急性强力伤害时立即出现的反应。 早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。 继而溶酶体破裂,细胞内含物流出, 引起炎症。,2、细胞凋亡 (cell apoptosis),Kerr（ 1972）最先提出，与细胞坏死的区别是： 细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体； 凋亡小体内有结构完整的细胞器； 不引起炎症； 线粒体无变化，溶酶体活性不增加； 内切酶活化，DNA有控降解，凝胶电泳图谱呈梯状； 凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化。,图1

17、4-6 细胞的两种死亡方式及其比较,细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是一种基因指导的细胞自我消亡方式。 PCD和细胞凋亡的区别在以下方面： PCD是功能性概念，凋亡是形态学概念。 PCD的最终结果是细胞凋亡，但细胞凋亡并非都是程序化的。 PCD存在于胚胎发育过程中。,3、细胞程序性死亡,编程性细胞死亡的特征,程序化细胞死亡具有明显的形态学特征，包括细胞变圆、染色质聚集、分块，胞质皱缩等。,图 正常的细胞与编程性死亡细胞形态比较 a.扫描电镜观察的正常T-细胞； b.扫描电镜观察的编程死亡的T-细胞的形态，表面可见许多芽； c.用抑制剂处理的正处于膜起泡阶段(

18、membrane blebbing stage)的编程死亡细胞的透射电镜照片。,编程性死亡细胞的DNA在核小 体连接处断裂成核小体片段，并 向核膜下或中央异染色质区聚集 形成浓缩的染色质块，随着染色 质不断聚集，核纤层断裂消失， 核膜在核孔处断裂，形成核碎片。 整个细胞通过发芽(by budding), 起泡(byzelosls)等方式形成凋亡小体 (apoptotic body)。,程序性死亡细胞的形态结构变化,或通过分隔机制：在凋亡细胞内由内质网分隔成大小不等的分隔区，靠近细胞膜端的分隔膜与细胞核融合并脱落形成凋亡小体。最后，凋亡小体被周围细胞或单核细胞吞噬 。,程序化细胞死亡最突出的生化

19、特征是染色质 DNA的有控裂解，并且是由于内源性内切核酸酶基因的活化和表达而造成的结果。 这种由内源性内切核酸酶切割的染色质DNA断片大小是有规律的，即都为200bp的倍数。 因此，抽提其中的 DNA，进行琼脂糖凝胶电泳时，或进行氯化铯溴化乙锭超速离心时，呈现出梯状(Ladder)谱型，可作为鉴别是否发生程序化细胞死亡的一个重要的生化标志。,图编程死亡细胞的DNA梯状谱型,表 程序性细胞死亡与细胞坏死的比较,二、 程序性细胞死亡的机理,1、程序化细胞死亡相关基因 程序性细胞死亡是基因调控作用的结果。 很多基因参与调控程序化细胞死亡过程，调控环节包括信号转导、基因表达、蛋白质生物合成和代谢过程等

20、。这些基因也叫程序化细胞死亡相关基因。,细胞编程性死亡可明显划分为四个阶段： 细胞命运的选择阶段 即细胞死亡的决定阶段 细胞死亡的的执行阶段 死亡细胞被吞噬阶段 死亡细胞的分解清除阶段,关于程序性细胞死亡的分子基础研究最初是在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，CE)中获得突破。 线虫的成虫分雌雄同体和雄性两种性别，雌雄同体相当于雌性。 虫体透明，有6对染色体，约3000个基因。 在胚胎发育期间，秀丽隐杆线虫有1090个体细胞，但在发育过程中有131个细胞死亡。因此，一个成熟的秀丽隐杆线虫有959个体细胞和约10002000个性细胞。,图 雌雄同体的秀丽隐杆线虫,线虫C

21、aenorhabditis elegans是研究个体发育和细胞程序性死亡的理想材料（生命周期短，细胞数量少）。 线虫神经系统由302个细胞组成。这些细胞来自于407个前体细胞。也就是说105个细胞发生了程序性死亡。 15个基因(大致可分为4组)分别在不同程度上与CE的PCD有关。控制线虫细胞凋亡的基因主要有3个ced-3、ced-4和ced-9 (ced：CE细胞存活的调控基因) ced-3和ced-4的作用是诱发凋亡；ced-9抑制ced-3,ced-4的作用. 真正的细胞杀手是ced-3，ced-3编码的蛋白与哺乳动物中的白细胞介素转换酶(interleukin-1(IL-1)-cover

22、ting enzyme, ICE)相类似。ICE属于日益扩大的半胱氨酸蛋白酶家族，该家族至少有30个成员，统称为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)。 Ced-4的作用是转换器(adapter)，对ced-3引起的程序性细胞死亡起促进作用。,图 秀丽隐杆线虫程序性细胞死亡途径及相关基因,第2组：执行死亡基因， ced-3、ced-4、 ced-9、egl-1 （线虫执行死亡的“死亡机器”，deathmachinery),第4组：死亡细胞在吞噬体中被降解的基因，nuc-1（核酸酶基因）,第1组：决定死亡基因， ced-1和 ced-2,第3组：死亡细胞被吞噬细胞所吞噬的基因， ced-

23、1、ced-2 、ced-5、ced-6、 ced-7、 ced-10和 ced-11,2002年10月7日，英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯特霍维茨和英国人约翰苏尔斯顿，因在细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔生理与医学奖。,Sydney Brenner,H. Robert Horvitz,John E. Sulston,2、程序性细胞死亡的过程,程序性细胞死亡分为两个阶段： 第一阶段是死亡激活期(activation phase)，此阶段主要是接受来自内部或外部的死亡信号(death signals)并做出反应，即接受指令并决定死亡。 第二阶段是死亡执行期(execution phase)，即执

24、行一套死亡程序，包括发生染色质凝缩, 并逐步分布在核膜周围；接着发生细胞质浓缩，此时桥粒和中间纤维的连接被破坏，膜泡形成凋亡小体，最后被吞噬细胞吞噬和降解。 程序性死亡的细胞之所以能够被吞噬细胞识别和吞噬，是因为这些细胞的表面具有“将我吃掉”的信号(被吞噬信号)，这种信号在正常细胞的表面是不存在的。 研究得最清楚的被吞噬信号是存在于程序化死亡细胞质膜脂双层外叶的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)分子，它一般存在于正常细胞质膜脂双层的内叶。,3、动物细胞中蛋白酶解级联系统对程序性细胞死亡的介导,所有的动物细胞都有一种相类似的控制程序性细胞死亡的机制，即通过一个自杀性蛋白酶家族的

25、介导，这种蛋白酶在诱导程序化死亡信号的作用下通过自我切割而激活。 激活的自杀性蛋白酶又可激活家族中的其他成员，引起蛋白质酶解的级联反应。 在该反应系统中，上一级的信号激活下一级的一个关键蛋白，并快速将其水解，从而使信号得以放大。最后，被激活的蛋白酶切割细胞与程序性细胞死亡相关的关键蛋白，如核纤层蛋白，从而快速引起有控制的细胞死亡。,蛋白酶解级联反应介导的 程序性细胞死亡 a)每一个自杀性的蛋白酶以非活性的形式存在，它可以被同一蛋白酶家族中的另一个成员裂解切割而自我激活。 b)每一被激活的蛋白酶分子能够切割许多蛋白酶分子，并将它们激活。以这种方式，开始激活的少量蛋白酶通过激活的级联反应，激活大量

26、的蛋白酶。 c)某些被激活的蛋白酶能够切割细胞内一些关键的蛋白，如核纤层蛋白，导致细胞有控制的死亡。,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase，cysteine-containing aspartate-specific proteases),级联反应中的自杀性蛋白水解酶就是caspase。 由于caspase家族的成员较多，作用时分成一些亚组分被激活，每一组caspase对应不同的激活信号。 caspase-3、-6、-7和-8 在FAS/TNF(肿瘤坏死因子)介导的程序性细胞死亡途径中起作用； caspase-9和caspase-3 一起参与线粒体中凋亡蛋白酶激活因子(apoptoti

27、c protease-activating factor， Apaf-I ) 、细胞色素c介导的程序性细胞死亡。 有两类caspase，一类是起始者(initiators)，一类是执行者(executioners) 起始caspase在外来蛋白信号的作用下被切割激活，激活的起始caspase对执行者caspase进行切割并使之激活，被激活执行者caspase通过对caspase靶蛋白的水解，导致程序性细胞死亡。,图 执行者caspase在程序性细胞死亡中的作用,能够被caspase切割的靶蛋白有几类： （1）蛋白激酶：caspase能够切割十多种蛋白激酶，如粘着斑激酶(focal adhesi

28、on kinase,FAK); PKB, PKC,以及Raf1。如果粘着斑激酶被破坏了，即破坏了细胞的粘着，使得细胞与相邻细胞失去粘着而导致程序性死亡。 （2）核纤层蛋白：是位于细胞核内膜下的一层纤维结构，对内膜具有支撑作用。核纤层蛋白被切割，导致核纤层解体、核被膜浓缩。 （3）细胞结构蛋白：一些维持细胞结构必需的蛋白质，如中间纤维、肌动蛋白和凝溶解胶蛋白(gelsolin)等被caspase切割后导致细胞形态的改变。 （4）与DNA修复相关的酶类遭caspase切割后失活。由于DNA的修复是维持细胞内环境稳定的主要因素，这一因素遭到破坏，合成的DNA难以保证正确，因而导致程序性细胞死亡。 （

29、5）caspase激活的DNase(CAD)抑制蛋白：caspase 能够将caspase激活的DNase(CAD)抑制蛋白水解，导致这种酶被激活。该酶是一种内切核酸酶，被激活后从细胞质转移到细胞核，与核DNA结合并将DNA切割成片段。,核酸内切酶活性升高是动物细胞凋亡最重要生化事件之一，已发现有20多种不同的核酸内切酶与动物的细胞凋亡相关。核酸酶大都是Ca2+/Mg2依赖性的，但它们之间并没有保守性。其中主要的有两种，在动物细胞的分子量分别为18kd和30kd。 凋亡过程中核酸内切酶的激活，导致DNA断裂。 第一阶段DNA被切成5300kbp高分子量大片段(High molecular we

30、ight , HMW)，并且这种断裂便足以引起染色质结构的崩解和随后的细胞死亡； 第二阶段一部分HMW片段被切成180bp左右的低分子量(Low molecular weight, LMW)小片段，参与这一阶段的核酸内切酶是Ca2+依赖性的，这些小片段用常规的琼脂糖凝胶电泳(分辨率为100bp300bp)可形成梯状条带，称之为DNA Ladder。 HMW片段用脉冲场电泳(Pulsed field gel electrophoresis PFGE，分辨率为100bp1Mbp)也能显示DNA Ladder。,核酸酶(DNase)和DNA的特异片段化,图 TUNEL标记研究细胞凋亡,这两个阶段不都

31、是由内切酶催化的，只有HMW片段的形成即第一阶段是所有细胞凋亡所必需的，而第二阶段LMW片段的形成并不发生在所有的细胞凋亡过程中。 细胞核DNA断裂时，形成大量3-OH端，可被末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端原位标记法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling TUNEL)标记，从而产生亮绿色荧光等。,程序性细胞死亡相关基因，大致可以分为两类： 一类是程序性细胞死亡遗传学相关基因，与程序性细胞死亡的遗传控制有关。主要获自线虫，如ced-1、ced-2 、ced-3、ced-4、 ced-9、ced-5、ced-6、 ced-7、 ced

32、-10、 ced-11 和 egl-1、nuc-1等， 另一类主要针对哺乳动物，是与细胞增殖有关的原癌基因、抑癌基因和病毒癌基因，参与对细胞凋亡的凋控。 1、其表达可促进程序性细胞死亡相关基因，ces-2、ced-3、ced-4、c-myc、p53、Ela 、ICE 、TNF-、APO-1/fas。 2、其表达可抑制程序性细胞死亡相关基因，egl-1、ces-1、 ces-9、bcl-2、Elb、EBV-LMP-1、BHRF-1、crmA、A-20等。,4、细胞凋亡相关基因及信号转导途径,1、c-myc c-myc（转录调节蛋白基因）对增殖和凋亡的调节是一样的。当生长因子存在，bcl-2基因表

33、达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。 2、bcl-2 细胞凋亡抑制基因，名称来源于B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/Leukemia-2，bcl-2)。 bcl-2能够编码bcl-2(26KD)和bcl-2(22KD)两种蛋白质，是膜的整合蛋白，主要存在于线粒体外膜、核膜及部分内质网中。 bcl-2的功能相当于线虫中的ced-9。,3、fas fas又称作APO-1，属TNF(肿瘤坏死因子)受体和NGF(神经细胞生长因子)受体家族。 1993年，人白细胞分型国际会议统一命名为CD95。 fas基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员。 Fas

34、蛋白与Fas配体组成Fas系统，可以启动凋亡信号的转导引起靶细胞凋亡。,4、ICE蛋白酶家族 ICE蛋白酶(白细胞介素转换酶)参与Fas诱导的细胞凋亡，与线虫细胞凋亡基因ced-3同源。 ICE又称为Caspase，能选择性降解蛋白质。 ced-4在哺乳动物中的同源体为Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)，能激活Caspase3 ，这一过程需要细胞色素c(Apaf-2)和Apaf-3的参与。,细胞外信号对程序性细胞死亡的激发,如果细胞外的信号 促进程序性细胞死亡， 则属于死亡的正控制。 若细胞外信号抑制 细胞的程序性死亡，则 是死亡的负

35、控制，将这 种信号称为存活因子 (survival factors)。 目前对存活因子是如何作用的，基本不了解。,图 受体介导的程序性细胞死亡途径,FAS/TNF,FASL/TNFR1,Fas诱导的细胞凋亡,Fas与配体(如TNF)结合发生三聚化，使胞内的DD区(Death domain)与接头蛋白FADD的DD区结合。 FADD N端通过DED区(death effector domain)与Caspase-8前体蛋白和CAP3结合，激活Caspase-8 。,Caspase-8自剪切活化，激活Caspase-3，Caspase-7、 Caspase-3激活Caspase-6。 Caspas

36、e可降解结构蛋白、信号蛋白、转录调控蛋白、周期蛋白等等。 Caspase还可降解CAD的调节蛋白，释放出CAD，CAD进入细胞核降解DNA。 CAD 为caspase-activated DNase，存在于胞质中。,细胞内信号对程序性细胞死亡的激发,除了外部信号激发程序性细胞死亡外，细胞内源信号也会激发细胞的程序性死亡，包括：DNA损伤、细胞质中Ca2+浓度过高、极度氧胁迫(产生大量的自由基)等。 在内源信号中有些是促进细胞死亡的正控制信号，如细胞色素c，凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease-activating factor，Apaf)。 内源信号中也有抑制细胞死亡的负控

37、制信号，如哺乳动物中的Bcl-2蛋白(Bcl-2 protein)和Bcl-x蛋白。,图线粒体介导的细胞凋亡途径,线粒体在CD95诱导的凋亡中的作用 线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且也是细胞凋亡调控中心。 Caspase引起线粒体渗透性转变，PT孔 (Permeability transition) 打开，导致线粒体的跨膜电位下降； 细胞色素C被释放到胞质中、激活Caspase-9，后者再激活Caspase-3。 Bcl-2，Bcl-xl均作用于线粒体， Bcl-2蛋白是将凋亡信号从caspase8向线粒体传递的信使。,4、程序性细胞死亡的生物学意义,在

38、健康的成年人体的骨髓和肠组织中每小时大约有十亿个细胞死亡。 动物机体靠对细胞增殖和细胞周期的正负控制，以及对编程性细胞死亡的正负控制来维持细胞总数的平衡和机体的生命活力。 细胞凋亡的失调导致疾病。如，细胞凋亡过渡：艾滋病、老年痴呆症、帕金森症；细胞增殖过渡：肿瘤、自身免疫性疾病等。,图 动物机体细胞数量控制的途径,编程性细胞死亡,形态建成中编程死亡起重要作用,如手指和脚趾在发育的早期是连在一起的，通过编程死亡使一部分细胞进入自杀途径才将单个指加以分开。 当蝌蚪变成蛙时，尾巴经编程死亡而消除。主要是血液中甲状腺激素的增加诱导细胞的编程死亡 。,编程死亡在小鼠足趾形成中的作用 （a）开始时足趾是相

39、连在一起的；（b）经编程死亡足趾分开,蝌蚪向蛙发育中变态反应的编程死亡,肿瘤发生的进程,从遗传上看，癌都是由一个细胞发展而来，由一个失去了增殖控制的细胞发展而来。 细胞的恶性转化需要发生多个遗传改变，即一个细胞发生多次遗传突变。因此肿瘤发生是一个渐进式的过程，涉及多级反应和突变的积累。 癌由正常细胞良性肿瘤(begign tumor)恶性肿瘤。 良性肿瘤的增殖也不受正常调控作用的控制，但不会侵染其它组织，不能进行远距离转移。,图 结肠癌和脑瘤恶性转变的多步发展过程,组织结构由有序向无序的变化,结肠癌发生的遗传渐进模型 在癌发展过程的不同阶段发生不同的基因突变，如APC基因（adenomatou

40、s polyposis colon，多发性结肠癌基因）是结肠癌发生过程中第一个发生突变的基因。而肿瘤抑制基因p53基因则是结肠癌发展过程的后期发生突变的基因。,抑癌基因、癌基因与原癌基因,癌的发生涉及两类基因抑癌基因(Tumor suppressor gene)与癌基因(oncogene)。 在正常的二倍体细胞中，每一种抑癌基因都有两个拷贝，只有当两个拷贝都丢失了或两个拷贝都失活了才会使细胞失去增殖的控制，只要有一个拷贝是正常的，就能够正常调节细胞的周期。 癌基因是细胞加速器，它们编码的蛋白使细胞生长不受控制，并促进细胞癌变。大多数癌基因都是由与细胞生长和分裂有关的正常基因(原癌基因)突变而来

41、。,图 抑癌基因与原癌基因突变对细胞的影响 抑癌基因突变对细胞的影响； 原癌基因突变对细胞的影响。,原癌基因(proto-oncogene) 原本是细胞的正常基因，编码的蛋白质在正常细胞中通常参与细胞的生长与增殖的调节。 突变后成为促癌的癌基因(cancer-promoting oncogene)，导致细胞癌变。 原癌基因突变成癌基因，称为原癌基因的激活。有几种可能的机制使原癌基因激活。,图 原癌基因激活成癌基因 a.原癌基因编码区突变；b.调节区突变；c.DNA发生重排,原癌基因与癌变,细胞增殖受一系列基因表达产物；蛋白质的控制，将参与细胞增殖控制的蛋白质分为7种类型。 1、生长因子，2、生

42、长因子受体，3、信号转导蛋白，4、转录因子，5、抗凋亡蛋白，6、细胞周期控制蛋白，7、DNA修复蛋白。 这7种类型的蛋白质中，有些是原癌基因的编码产物，它们突变后会导致细胞癌变。 编码1-4类蛋白的原癌基因，突变是显性突变（1个拷贝突变）； 编码5、6类蛋白的肿瘤抑制基因，突变是隐性突变(2个拷贝突变) ； 编码7类蛋白的基因突变，导致在代谢过程中造成的DNA损伤不能修复，会极大地提高其它类型突变的概率。,表原癌基因与人类肿瘤,原癌基因突变成癌基因后，其编码产物促使细胞生长不受控制，并使细胞向恶性方向转变。有些癌基因编码活性过度的受体或活性过强的细胞内信号转导蛋白，它们可在没有外源信号的情况下

43、促使细胞过度增殖而癌变。,图 正常的细胞增殖与由癌基因引起无限增殖的比较 a)在正常的静息细胞中，细胞内能被细胞外信号激活的蛋白和基因都是非活性的； b)当正常细胞受到细胞外生长因子刺激时，信号蛋白和基因被激活, 细胞进行增殖； c)在癌细胞中，编码信号蛋白的基因突变成为癌基因，其产物不再需要细胞生长因子的作用就具有活性。,抑癌基因与癌变,正常细胞转变成癌细胞，是由于一个或多个抑癌基因丢失的结果。 目前推测，人的基因组织中大约有20多种抑癌基因。其中包括编码转录因子的基因（p53和WT1）、编码细胞周期调节因子的基因（RB和p16）、编码参与信号转导途径调控蛋白的基因（NF1）等。 在正常细胞

44、中，抑癌基因的产物作为细胞增殖的负调控器，因此，它们的突变将会使细胞的增殖失去控制。,表 部分抑癌基因的功能及突变后引起的肿瘤,在第十三条染色体上表达的Rb基因,成视网膜细胞瘤发生在幼儿身上，影响一岁的儿童达20,000名。肿瘤从未成熟视网膜-担负检测光和颜色的眼睛部分-发展而来。患此症的小童眼睛多为白色，那是因为肿瘤长于眼球内，令瞳孔呈白色而致。 成视网膜细胞瘤如果不治疗，几乎是致命的，但如果早期诊断并采用现代方法治疗，其生存率超过90%。,RB基因,RB基因是世界上第一个被克隆和完成全序列测定的抑癌基因，为视网膜母细胞瘤易感基因，编码的蛋白称为Rb蛋白，分布于核内，是一类DNA结合蛋白。

45、Rb蛋白的磷酸化/去磷酸化是其调节细胞生长分化的主要形式，一般认为Rb蛋白在控制细胞周期的信息系统中起关键作用，脱磷酸化的Rb具有抑制细胞增殖的活性，是Rb的活性形式。 RB基因与癌有两种情况：一种是某些家族的青少年人中高频率发生成视网膜细胞瘤；另一种是高龄人中发病的无家族关系。从成视网膜细胞瘤发生的家族性表明该病是可遗传的。 关于成视网膜细胞瘤的遗传基础，1971年得到了解释：只有在RB基因的两个拷贝都突变后才会发展成为成视网膜细胞瘤。,在第17条染色体上P53基因表达,利弗劳梅尼综合症（LiFraumeni）是一种家族性遗传病，它对多种癌症，包括乳腺癌和白血病有遗传倾向。 利弗劳梅尼综合症

46、基因携带者通常会把这种基因遗传给孩子，在孩子活到45岁时，将有50的可能患上与利弗劳梅尼综合症有关的癌症；而孩子活到60岁时，这种可能性就增加为90。,p53基因,p53基因编码一种相对分子质量为53kDa的磷酸化蛋白质，命名为P53。 P53蛋白主要集中于核仁区，能与DNA特异结合，其活性亦受磷酸化调控。正常P53的生物功能好似“基因组卫士” (guardian of the genome) ，在G1期检查DNA损伤点，监视细胞基因组的完整性。 如有损伤，P53蛋白阻止DNA复制，以提供足够的时间使损伤DNA修复；如果修复失败，P53蛋白则引发细胞凋亡。 如果p53基因突变，无P53蛋白合成

47、，细胞会发生癌变或死亡。,图 P53蛋白的作用模型 a. p53基因正常，DNA损伤信号使P53蛋白而升高，促使DNA修复，如不能修复，细胞则进入程序性细胞死亡。 b. p53基因突变，DNA损伤不能修复，导致肿瘤发生或细胞死亡。,化学和UV致癌物的作用机制,图中p53基因中7个密码子，这些密码在人的癌症病人中有50%会发生缺失或突变,CDK抑制蛋白控制细胞增殖,CDK：细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶,细胞有严格的自我调节机制，控制着细胞增殖的质量。如DNA因某种原因造成损伤后，细胞被阻止在S期，G2期就不能进行。在这一调控过程中，CDK抑制蛋白(Cdk inhibitor proteins)起重

48、要作用，这些抑制蛋白可以阻止Cdk的装配或抑制Cdk的活性。 当DNA在S期受到损伤时可使抑癌基因P53的产物P53蛋白浓度升高，P53蛋白进一步激活编码Cdk抑制蛋白P21基因的转录和表达，合成的P21蛋白抑制S-期周期蛋白-CDK复合物的活性，一直等待受损伤的DNA修复和正确复制之后才进入G2期 。 当DNA受到损伤时，P53蛋白合成增加，并被激活；激活的P53促进编码CDK抑制蛋白P21的基因转录。P21蛋白与S期周期蛋白-CDK复合物结合，并使它们失活，因此，细胞被阻止在G1期。,病毒癌基因与癌的诱发,就癌基因的来源分为两类， 一类是细胞癌基因(cellular oncogene，c-

49、onc)，由细胞原癌基因突变而来； 一类是病毒癌基因(viral oncogene，v-onc)。 许多致癌病毒中的癌基因不仅与致癌密切相关，而且与正常细胞中的某些DNA顺序同源，推测病毒癌基因起源于细胞的原癌基因。 大约已经鉴定了100多种不同的癌基因，它们中的大多数属于RNA肿瘤病毒基因组中的基因。某些DNA病毒也能引起细胞癌变。,表 部分DNA和RNA肿瘤病毒,植物细胞凋亡与细胞增殖具有同等重要的生理意义， PCD在生长发育中，特别是在维持体内器官、组织和细胞数目相对平衡、转化、形态建成、内环境稳定与防病、抗病过程中发挥重要作用。 植物细胞凋亡的研究起步较晚，虽然早在20世纪80年代起就

50、有许多关于植物细胞凋亡现象的报道，但直到1994年，Greenberg等才提出植物细胞程序性死亡的概念。他们发现植物受病原体侵染时，自身的抗病基因被激活，同时促使感病部位的细胞死亡，抑制病原体的进一步扩散，这一现象被称为过敏反应(Hypersensitive Reaction HR)，在过敏反应中观察到某些细胞死亡与动物细胞凋亡的类似特征而提出植物细胞程序性死亡的概念。,5、植物细胞凋亡,植物除病理条件下出现细胞凋亡外，正常生长发育过程中及逆境胁迫下某些细胞都会出现类似的凋亡的形态和生化事件。 如：正常生长发育过程中如木质部的形成、胚胎发生、花的败育、叶片衰老甚至性别分化等；逆境条件下的如植物

51、毒素、小分子化合物（SA、H2O2等）、盐水胁迫、重金属离子以及营养缺等、冷胁迫和热激、甚至紫外辐射（UV）等在一定条件下也都可诱导植物细胞凋亡。 植物细胞凋亡与细胞增殖具有同等重要的生理意义，同植物的生长、发育、抗病以及抗逆境等密切相关，对维持植物体内的自身平衡以及植物与环境的对立统一起着决定性作用。 如何准确了解植物细胞凋亡的形态生化特征、基因调控规律及其信号传导机制，进而人工控制细胞凋亡成为当前生命科学研究领域的热点之一。,植物发育过程的PCD现象,胚柄细胞PCD,胚柄（Suspensor）的降解：胚柄是受精卵不均等分裂时形成的，其主要作用是为胚胎发育提供营养，而当胚胎发育到一定的阶段，

52、胚柄会逐渐开始凋亡、消失，成熟种子中不复存在。 上世纪80年代，Nomnra 和Komamine在诱导悬浮培养的胡萝卜体细胞形成胚的研究中在电子显微镜下，观察到胚柄凋亡细胞与正常细胞的区别：出现质壁分离，原生质固缩等类似凋亡的特点。 拟南芥（Arabidopsis thaliana）的胚柄细胞在胚发育至鱼雷期时就会凋亡，Schwartz等研究发现，拟南芥胚柄细胞的凋亡与susl, sus2, sus3 基因密切相关，这些基因如果发生隐性突变，就会导致胚发育至心形期时其胚柄细胞不发生凋亡，而是继续生长形成一个大胚柄，从而破坏了胚的正常形态。 对拟南芥双胚突变体（twn）的研究表明，twn 基因与

53、胚的正常发育密切相关，一旦twn 基因突变，胚发育至球形期时，就会在原生胚柄上形成次生胚和次生胚柄；随后，双胚间的原生胚柄细胞首先凋亡，然后才是次生胚柄凋亡。由此推测，胚可能会产生某种信号，诱导或抑制胚柄细胞凋亡。,糊粉层细胞PCD,糊粉层（Aleurone layer）的降解：糊粉层是一些单子叶植物种子储藏蛋白体的组织，当种子萌发时，为胚提供营养。 种子萌发时糊粉层细胞逐渐降解，其形态变化体现典型的凋亡特征，细胞器减少，细胞质和细胞核固缩，DNA降解。,图 糊粉层降解的自吞噬小体的形成,根的发育,根冠的发育 根发育过程中，根冠细胞和根皮层细胞发生PCD而形成死细胞壁保护根的分生组织。 Wan

54、g以DNA染色法处理趋于死亡洋葱根冠细胞发现核浓缩，通过TUNEL试验，发现洋葱根冠的最外13层细胞中有DNA3OH片段累积，表明根冠细胞死亡过程为PCD。 通气组织的形成 在土壤低氧环境或其它胁迫下，根部通过PCD形成通气组织。如在玉米根在氧胁迫下，细胞启动凋亡，细胞内物质被合理输出。在这些过程中，DNA梯度和核致密化等特征都被证明存在。,导管分子形成,维管植物中导管及筛管形成是最典型的PCD过程。 悬浮培养的百日菊（Zinnia elegahs）叶肉细胞培养诱导导管分子的形成，为研究导管分子细胞凋亡过程的形态和生化变化提供了帮助。 形成导管分子的叶肉细胞凋亡与动物细胞凋亡不同。 植物凋亡细

55、胞的细胞内物质是在液泡中降解，细胞壁不被吞噬掉。而动物凋亡细胞则是形成凋亡小体，被相邻的细胞吞噬。但是，形成导管分子的凋亡细胞也有许多形态特征与动物相似，如DNA片段化，形成凋亡小体。 Mittler对豌豆根尖导管分子的原位检测也证明了这一点。在 对番茄叶片导管分子的形成进行的研究中又得到了进一步证实.,导管及筛管形成过程中的PCD,导管分子形成,Fukuda认为从叶肉细胞再分化为导管可分为三个阶段： 叶肉细胞脱分化； 脱分化细胞分为不成熟的导管； 细胞进入死亡过程，形成次生壁,生殖过程中PCD,植物的生殖是个非常复杂的过程，在此过程中，大孢子和小孢子的败育，雌蕊原基细胞的退化（性别决定），花

56、瓣的凋谢、花粉的成熟都是通过PCD来完成的，在受精过程中，花粉管的伸长需要周围的雌蕊传导组织细胞通过PCD来提供营养和机械支持。 许多植物表现为单性花，但在花原基分化时，都存在雌雄器官原基，PCD在植物单性花发育过程中发挥着重要作用。 植物雄性不育实际是从小孢子发生到雄配子体发育的不同阶段，小孢子或雄配子体发生PCD等造成的。 当环境条件改变或控制绒毡层细胞发生PCD的基因发生突变，导致绒毡层细胞提早或延迟凋亡，导致花粉败育；也有可能由于绒毡层细胞凋亡异常行为，提供给花粉发育错误的信号，启动花粉粒基因组中已存在的PCD基因，使花粉粒细胞凋亡，导致花粉败育。长日照诱导光敏度不育水稻花粉败育，很可

57、能是由于细胞凋亡引起的。,腺体形成的PCD许多植物腺体形成也是一种细胞PCD过程。例如柑橘类植物的叶片和果皮的挥发性油腺体形成过程，细胞自我解体，形成组织空洞腺体。 植物衰老中PCD衰老是在植物生长发育的最后阶段，并且发生许多细胞与器官自然程序化死亡，是植物发育过程中的一种主动的生理过程，既受各种环境因子影响又受核基因控制。,植物细胞凋亡的分子生物学研究和调控,激素的调控作用 赤霉素能诱导糊粉细胞凋亡。ABA则能阻断GA效应，延缓种子萌发，延缓糊粉细胞凋亡。 乙烯在植物PCD中也起重要作用。虽然也可能存着不依赖于乙烯的PCD。例如，缺氧诱导的玉米根皮质部气生组织形成过程中，乙烯通过增高胞内Ca

58、2+ 浓度，引起细胞凋亡，导致气生组织的形成。Young等也发现在小麦胚乳中，乙烯浓度能够部分地调节核内DNA的降解。提高乙烯浓度能够使DNA降解提早出现，而抑制乙烯的浓度可以降低或延缓DNA降解。 目前认为赤霉素和乙烯可以诱导PCD，而ABA、CTK等激素对PCD有抑制作用。 除了植物激素外，有研究报道一种磷脂酶抑制剂冈田酸(okadaicacid),它能够阻断Ca2+通道，抑制由GA诱导产生的谷类作物糊粉细胞的凋亡。,植物中PCD的研究起步较晚，但也得到一些与凋亡有关的基因。 acd1、acd2基因 acd1、acd2是Greengerg等从拟南芥以HR突变体中分离的基因。野生型的拟南芥在

59、正常情况下不出现HR，而acd基因突变体在野生型不出现HR的情形时也表现出HR，并类似于野生型有病原体刺激下出现的HR症状和特征。因此推测acd基因在拟南芥的HR诱导的PCD中起负调控作用。 Pto基因 Pto基因是番茄中的抗病基因，编码一类丝苏氨酸蛋白酶，属于一个多基因家族，通过识别病原体Pseudomonas syringae pv tomato上相应的avrPto，激活下游的信号转导途径而启动番茄的HR。 BEN1和ZEN1基因 BEN1是大麦中分离的编码一个35KD的核酸酶的基因，其产物含有288个氨基酸残基，推测含有23个氨基酸残基的信号肽。BEN1蛋白可能与胚乳退化过程中发生的PCD有关。ZEN1是从百日菊分离的编码一个43KD核酸酶的基因。其产物由303个氨基酸组成，推测含有一个25氨基酸残基的信号肽。ZEN1可能在导管的分化中发挥作用。BEN1与ZEN1的氨基酸顺序同米曲霉（Aspergillus oryzae）的S1核酸酶有很高的同源性。 hsr203、Lehsr203基因 hsr203是烟草基因，其活性出现于烟草与病原体相互作用之时。Hsr203启动子与GUS的融合基因在烟草中可被细菌或病毒病原体诱导表达，表明它与烟草HR中