TG电转感受态制备与主要影响因素.ppt

1、大肠杆菌减胎细胞的制备及质粒DNA切换，2014-12-23，相关概念实验原理方法特性实验阶段影响因素，减胎细胞受体细胞采用电击法，CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂法等特殊方法处理后的细胞膜。变形是将外源DNA分子引入受体细胞，获得新遗传特性的手段，是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。1，相关概念，2，实验原理，化学方法CaCl2法基于孟德尔和海尔(1970)的发现，其基本原理是细胞在0 4的CaCl2低渗透溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球形。使混合物的DNA变形，形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘在细胞表面，经过42，90秒的热冲击处理，促进细胞吸收DNA混合物。

2、DNA分子通过克隆、表达和基因信息传输，使细胞获得新的遗传特性。经常准备的感性菌株，如DH5，TOP10，DE3，JM109。电转化法电转化法利用瞬间高压全脉冲，在细胞表面形成暂时的孔隙，在细胞膜表面形成小孔，电冲击作用促进细胞膜融合，最终在细胞膜上形成大孔度，使DNA容易进入。经常准备的易感菌株：TG1。用化学感觉细胞制备，70冷冻菌种，刮除法将细菌接种在培养皿上做标记，在37中过夜。第二天，在平板电脑上选择单个菌落，接种到包含3ml LB培养液的试管，用37振动培养度过了夜晚。第二天，1ml接种菌液在含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中进行了37次剧烈振动，培养了约23小时(200

3、300r/min)。菌落600nm OD值达到0.30.4时，取出烧瓶，放在冰上1015分钟。无菌状态下将菌液倒入50毫升离心管。4,4000g离心10分钟。扔掉青青，把管子倒放在干滤纸上，吸掉剩下的培养液。将10毫升0.1米的CaCl2放入离心管，振动混合，悬浮菌体，冰浴30分钟左右。4,4000g离心力10分钟，扔掉上清，将管道倒放在干滤纸上，吸出剩下的培养液。再加上4毫升冰预冷0.1米的CaCl2，就成为中显菌体。建议每个管道使用0.2ml分支，等待保管到4，2448小时内使用。暂时不用的话，可以再放在70的低温冰箱里保管。TG1前感受性细胞的制备，用10ul无菌枪头选择TG1单克隆下划

4、线接种到2YTG板块(2YT培养基中加2的葡萄糖)，培养了37夜。选择TG1单克隆作为25毫升2YT培养基，250rpm，37晚培养基。早晨摇晃栗子的菌液分别将500毫升2个2YT培养基中的250rpm，37摇到OD6000.6。接下来的工作都在冰上进行。将摇晃的菌液在超顺台无菌500毫升离心杯，分为2个4，3000rpm离心10min。在初定台小心地倒入清液，10毫升预冷10甘油中显菌体，将预冷10甘油放入总体积500毫升。4，3000rpm离心10分钟。去除甘油常清液，10ml预冷10甘油中显菌体，将菌液转移到离心病。将预冷10甘油放入总体积500毫升。另一种离心病用水平衡。4，3000r

5、pm离心10分钟。加入甘油常清液，10毫升预冷10甘油中显菌体，预冷10甘油总体积250毫升。另一种离心病用水平衡。4，3000rpm离心10分钟。甘油常清液，2.5毫升预冷10甘油中显菌体，无菌枪头吸出100ul/管，放入1.5ml微量离心管(离心管做标记，-80至少30分钟的冷冻保管)。立即将带电或离心管放入液氮中，冷冻至少一个小时，然后放入-80董洁保管。各种方法的特点、一般结构曹征菌株、化学方法可以应对，但在构建大容量基因库和抗体库时，要提高转换效率，采用传记转换方法是最好的方法。测量E. Coli的生长曲线，04 h到E. coli的细菌浓度(A600nm)，然后绘制对数生长曲线(A

6、600nm 1)，如下所示：E.coli TG1和E. coli DH5a的生长曲线均开始呈100min后代数生长趋势，在10015O min之间E. coli TG1株的生长速度比E. coli DH5a株快。E.coli DH5a对不同时间的转换效率，注：传记冲击杯间距为02 cm，E.coli TG1对不同时间的转换效率，注：传记冲击杯间距为02 cm，E.coli讨论对数期间不同时间的转换效率，选择对数生长期的细胞的检测状态细胞不能达到对数生长期或选择大于对数生长期的细胞，转换效率非常高对代数生长期大肠杆菌菌株(A600nm 02 10之间)的传记转化效率进行了比较，通过E. Coli

7、的生长图，可以看出两株的生长趋势基本一致，但前后期间存在差异。如果和E.coli一起徐璐看不同时间的切换效率，当被问及在相同条件下准备的感性细胞、大肠杆菌TG1牙齿A600nm牙齿0507时，可以发现其转化率明显高于其他时期。(威廉莎士比亚，Escherichia Coli，Escherichia Coli，TG1) Ecoli DH5a有两个最高点。A600nm位于0305和0709之间，即日志增长的初期和后期。而且DH5a的最大转化率高于TG1。这是因为菌株大小、形状、细胞壁、细胞膜组成不同，对相同强度的传记脉冲的敏感度不同，不同时期活细胞的数量也不同，因此不同菌株在不同时期的转换效率也不

8、同。质粒DNA的杨怡不同会影响E.coli转换效率，质粒DNA的结构、大小和含量对传记转换效率有很大影响。讨论了PUC19作为质粒材料的含量对传记转换效率的影响。在40ul菌液中分别加入0.25 ng、0.5 ng、1.0 ng、1.5 ng等4茄子不同含量的粒子DNA，结果表明使用1.0 ng质粒DNA时传记转换效率最高。但是，如果添加的外源DNA的杨怡太多或体积太大，转换效率可能会下降。也就是说，DNA溶液的体积渡边杏超过感觉细胞体积的5%，1 ng的质粒DNA能使50ul的感觉细胞饱和。传记脉冲强度对传记转换效率的影响，电场强度的影响机制比较复杂，目前还不知道。Kimoto的研究表明，在

9、传记脉冲之前，DNA和细胞是随机分布的。传记脉冲早期、DNA和细胞向阳极移动。在传记脉冲的后期，DNA插入细胞的外膜，或进一步进入细胞的门缝。然后，37孵化机要求DNA渗透通过内膜进入细胞池。在高场强下，可以立即穿透细胞壁和质膜，形成通过外源物质的跨膜通道。在低场强的作用下，累积电荷必须达到一定强度才能用于质膜，形成孔已形成孔的细胞可能会因内容物的流出而死亡。因此，选择合适的脉冲强度对外源DNA的诱导至关重要。战前市注意事项，1 .防止杂菌和杂DNA的污染。整个操作过程必须在无菌条件下进行，使用的器皿必须灭菌所有试剂，防止被其他试剂、DNA酶或大麻DNA污染。否则会影响转换效率或杂交DNA的转移。2.感觉细胞长时间处于常温状态会严重影响转化率，所以要尽量减少常温操作，动作要快。3.为了减少对细胞的机械损伤，操作时动作严重，就会渡边杏。4.触电后一定要温