放射免疫标记

1、放射免疫分析是一种以放射性核素为示踪剂的标记免疫分析技术。它常用于被测样品中微量物质的定量测定，广泛应用于内分泌学、免疫学、药理学、微生物学、生物化学等领域。然而，放射免疫分析总是不同程度地伴随着放射性污染，并逐渐被其他免疫标记技术所取代。放射免疫分析的类型主要包括：放射免疫分析(RIA)、免疫放射分析(IRMA)和放射免疫分析(RIA)，放射免疫分析是一种通过结合一定量的特异性抗体和放射性核素标记抗原来确定待测抗原含量的竞争性免疫方法。这是经典的放射免疫分析法。这是目前使用最广泛的放射免疫分析法。免疫放射分析(IRMA)，也称为免疫放射分析，是一种通过放射性核素标记的抗体和待测抗原之间的非竞

2、争性结合反应来确定待测抗原含量的非竞争性免疫学方法。1.放射性核素标记的制备。放射性核素标记是指由放射性核素标记在靶抗原或抗体上形成的放射性标记抗原或抗体，是放射免疫分析试剂盒的主要组成部分。放射性核素是指原子核能自发地改变其组成或能级，然后变成另一种放射性核素，这种放射性核素伴随着射线的发射。放射性的单位是：放射性、放射性比活度和放射性浓度。放射性每单位时间的核衰变数，即每秒的衰变次数，用贝克勒尔(Bq)表示为1Ci=3.71010Bq。放射性比活度是指单位质量样品中所含的放射性，用Bq/g或Bq/mmol表示的放射性浓度是指单位体积溶液中所含的放射性。放射性核素类别，根据衰变方式，有三种，

3、还有两种用于放射性标记；分别用液体闪烁计数器和计数器测量。目前常用的是类放射性核素，如125I、131I、51Cr和60Co，125I是最常用的；第一类放射性核素是3H、14C和32P，其中3H是最常用的。以125I和3H为例，比较它们的特性(表19-1)。表19-1 19-1 125I和3H标记物的特征比较、放射性核素选择原则、高比活性、合适的半衰期、不损伤抗原或抗体和易于标记。125I最接近理想条件，其比活性为6.4381014Bq/g，而14C的最大比活性为16.651010 bq/g。如果标记量相同，125I的灵敏度比14C高3900倍。(2)抗原或抗体，用于放射性标记的抗原或抗体的质

4、量直接影响分析的灵敏度和特异性；用于标记的抗原需要高纯度和足够或完全的免疫活性。用于标记的抗体应具有高亲和力常数、低交叉反应率和高抗体滴度。(3)放射性核素标记物的制备，放射免疫法和IRMA法分别用放射性核素标记抗原和放射性核素标记抗体检测抗原。以放射性核素125I标记抗原为例，说明了标记物的制备。1直接标记法是将125I直接结合在蛋白质侧链酪氨酸残基的苯环上，形成单碘酪氨酸或二碘酪氨酸。操作简单，结合效率高，但只能标记含酪氨酸的化合物，这有时会损害蛋白质的活性。2。间接标记，也称为链接标记。这种方法是将放射性碘连接到小分子载体上，然后将这种小分子载体与蛋白质结合。代表性的方法是Bolton-

5、Hunter法，使用的载体分子是N-琥珀酰亚胺3-(4-羟基苯基)-丙酸(SHPP)。标记方法分为两个步骤。第一步是用氯胺T法对SHPP进行碘化，第二步是将碘化的SHPP分子与蛋白质分子偶联。(4)放射性标记的纯化和鉴定。1.放射性标记物的纯化可以通过葡聚糖凝胶过滤或薄层色谱、纸色谱、电泳、高效液相色谱等进行。2.放射性标记物的鉴定理想的放射性标记物是高放射化学纯度、适当的特定放射性和免疫活性。(1)放射化学纯度指与抗原结合的辐射强度占总辐射强度的百分比；即碘化蛋白质峰的辐射强度占总辐射强度的百分比。影响因素：是不纯的，杂质也被放射性核素标记。标记后分离纯化不完全；标记化合物储存期间的碘脱落。

6、(2)放射性比活度，或放射性比，是每单位质量标记物的辐射强度，其单位是Bq/g。标记抗原的放射性比活度越高，所需的标记抗原量越少，实验系统的灵敏度越高。然而，过高的比放射性可能损害抗原的免疫活性。例如，碘标记的化合物应该用单碘标记。(3)免疫活性是指抗原结合抗体的辐射强度与总辐射强度之比。以便检查标记后免疫活性损失。方法是加入10倍的抗体与标记的抗原反应，测量结合部分(B)和游离部分(F)的辐射强度，计算B/B F的百分比，正常值应在80%以上，数值越大，抗原损伤越小；如果数值太小，标记的抗原应被加强或丢弃并重做。第二，抗体的选择，抗体也是放射免疫测定试剂盒的主要组成部分之一，通常使用含有特异

7、性抗体的抗血清和小鼠杂交瘤单克隆抗体。抗体的质量直接影响分析的灵敏度和特异性。抗体的质量指标主要包括亲和常数、特异性和效价。第三，免疫复合物分离技术，在放射免疫分析的反应体系中，由于抗原和抗体的含量极小，形成的免疫复合物不沉淀。在反应平衡状态下，银-硼络合物和游离银的放射性必须用适当的方法测量。理想的分离技术合格、简单可行，适合大规模样品分析；分离效果彻底、快速，非特异性结合低；试剂来源简单，价格低廉，稳定性好，可长期保存。不受外部因素和样品中其他成分的干扰，对标准物质和待测抗原具有相同的分离效果；它适用于自动分析。目前还没有完全满足上述条件的分离方法，常用的是免疫复合物的分离方法。1.吸附法

8、是用吸附剂(如活性炭)来吸附游离的小分子。2.化学沉淀法的反应条件接近抗体的等电点。加入聚乙二醇等蛋白质沉淀剂可以破坏蛋白质分子表面的水合层，使蛋白质沉淀，从而分离出B3。双抗体法利用抗抗体和抗体在银抗体复合物中的结合形成一个较大的免疫复合物，通过离心沉淀可以将抗体和抗体分离。双抗体法和聚乙二醇与4PR试剂相结合的沉淀法可以弥补各自的不足，分离效果好，适用范围广。5固相分离法将抗体或抗原结合在固相载体上(如磁性颗粒、聚苯乙烯管或珠粒等)。)，用固相抗体或抗原分离B和F，简单、快速，适合自动化分析，并已逐渐取代传统的液相分离方法。核射线检测仪器由两部分组成：射线检测器和后续的电子单元。核射线探测

9、器是一种能量转换器，它的探测原理是当射线作用在闪烁体上时，闪烁体吸收射线的能量并激发闪烁体中的原子或分子。当被激发的原子或分子被去激发时，光子进入光电倍增管的光电阴极，并被转换成光电子，光电子在光电倍增管的电场作用下到达阳极，形成电脉冲。转换方式为辐射能、光能和电能脉冲。第二部分是放射免疫分析法，它是由美国的贝尔松和雅罗于1959年建立的，他们首先用放射性碘标记的胰岛素来测量血清中的胰岛素含量。开创体外微量物质检测的新时代。他获得了1977年的诺贝尔生物医学奖。原理：基本原理是抗原抗体竞争结合反应，即，1.抗原抗体反应是待测抗原与抗原标准和抗体之间的竞争性结合反应。根据取样顺序的不同，放射免疫

10、分析可分为两种类型：平衡法使银和银同时与抗体反应，达到平衡后将银-抗体和银分离。方法稳定，但灵敏度稍差；顺序饱和法使银和Ab充分反应，达到平衡后加入银，提高了灵敏度，但不如平衡法稳定。气液分离气液分离技术如第一节所述，应注意气液分离是否是实验成功的关键。为了使测量结果能代表反应结果，要求分离方法能完全有效地分离B和F，且分离不应破坏已达到动态平衡的免疫反应。因此，通常需要提高分离速度、降低操作温度并缩短分离剂和反应系统之间的接触时间。3.放射性强度测量根据放射性核素的类型，选择液体闪烁计数器(类型)和计数器(类型)来测量每个待测样品和抗原标准的银-抗体放射性(b)或游离银放射性(f)。4。数据

11、处理：(1)制作标准曲线：制作标准曲线时，纵坐标为放射性反应参数，可以用多种方式表示，如B/F、B/T、F/B、B/B0的比值或B或F的cpm值，B/B0的比值常作为参数。横坐标是已知标准物质的浓度，用算术数或对数表示。放射免疫测定的标准曲线是双曲线(图19-2)。放射免疫分析标准曲线的类型为：(1)以标准物质浓度为横坐标，以百分之二或百分之二、百分之二和百分之三为纵坐标，呈双曲线函数；(2)以标准物质浓度的对数为横坐标，以B%或B/F、B/B0、cpm为纵坐标，曲线呈倒S形；(3)以标准浓度的算术数(或对数)为横坐标，以F/B(或B0/B)为纵坐标，为双曲函数；(4)以标准浓度的对数为横坐标

12、，以Logiteb/B0为纵坐标，标准曲线为从左到右递减的直线。(2)抗原含量的计算根据待测抗原管的放射性强度计算相应的反应参数值，然后从标准图中检查待测抗原的相应含量。第三，方法学评价：放射免疫分析法灵敏度高，可测定微克/升，甚至微克/升或微克/升；特异性强，与结构相似的物质交叉反应少；准确度高，重复性好，批内误差低；少用血。放射免疫分析的缺点是放射性核素对环境和实验室的污染；放射性核素易衰变，放射性标记物不稳定，导致试剂有效期短。1968年，Miles和Hales成功地使用同位素标记的抗胰岛素抗体来检测牛血清中的胰岛素。IRMA比RIA更敏感。原理免疫放射分析的原理属于非竞争性免疫结合反应。放射性同位素被标记在抗体上，过量的标记抗体(ab)与待测抗原反应，反应式为AgAb=AgAb-Ab Ab。充分反应后，除去游离的标记抗体，银-抗体偶联物的放射性强度与待检测抗原的量成正比，即待检测抗原的含量越多，复合物的计数率越高，计数率越低。反应公式如下：Ag Ab *(过量)AgA-Ab * Ab *，IRMA方法学，单点IRMA法(图19-3)，双位点IRMA法(图19-4)，单