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文档简介

1、考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量,实验目的,了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理 掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作步骤,实验原理,考马斯亮蓝G250在酸性的溶液中游离状态呈红褐色，与蛋白质结合后呈蓝色，其最大吸收波长由465nm转变为595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，595nm处的光密度值与蛋白质浓度成反比，可用比色法进行蛋白质定量测定。,仪器和试剂,1仪器：分析天平；吸管0.1ml1、1ml2、5ml1；试管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml、1000ml各一个； 2试剂： （1）0.9% NaCl溶液； （2）标准蛋白质溶液：称取10mg 牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至

2、100ml，制成0.1mg/ml 的原液。 （3）考马斯亮蓝G-250（0.01%）染液：称取0.1g考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液不宜久存，在常温中可放置1-2个月。 （4）样品液：取牛血清白蛋白0.1mg/ml 的溶液，用0.9% NaCl溶液稀释至一定浓度。,操作步骤,10100gmL标准曲线的制作： 取6支试管，编号后，按下表加入试剂，混匀，室温静置5min后，以管1为空白对照，在595nm下比色测定。以标准蛋白质含量（g）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。,2样品中蛋白质含量的测定

3、另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。,计算,样品的蛋白质含量（g/g鲜重）=查得的蛋白质含量（g） / 样品鲜重（g）,注意事项,1. 如果要求严格，最好在试剂加入后的520min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。 2测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。,思考题,1 说出你所知道的几种蛋白质定量测定的方法，并与考马斯亮蓝染色法相比较各有何优缺点？ 2根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用的方法测定蛋白质的浓度。 （1）样品不易溶解，但要求结果较准确；

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