质粒改造-修改.ppt

1、质粒改造,赵雨佳 张楠楠,实验流程:,DNA重组技术,质粒改造历程,阅读质粒图谱,实验常见问题及注意事项,领域最新进展或现实意义,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1,pBR313和pBR322。 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体

2、，表达型载体及各种探针型载体。,发展概况,质粒改造历程,1）pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。最早应用于基因工程的载体之一。 2）由pSF2124、pMB8及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。 3）把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。,pBR322,重要的大肠杆菌质粒载体,4）过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。 此外，pBR322DNA，被限

3、制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准。,松弛型复制,pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50 - 100 / cell,用于基因克隆,pUC质粒系列,pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。 它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ 基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker.,三个显著特点： （1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。 （2）含易于检测是否有外源

4、DNA插入的标记基因LacZ，可利用-互补原理进行蓝白筛选。 （3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。 其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。,476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5-序列，表达半乳糖苷酶的片段。 LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。 lacZ之内是M13的多功能连接器。,第一步：了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）：是否含有表达系统元件，即启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。选用哪种载体要以实验目的为准绳。 第二步：再看筛选标

5、记，如抗性. Ampr：水解p一内酰胺环，具氨苄抗性。 tetr：阻止四环素进入细胞。 camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 neor(kanr)：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418(卡那霉素衍生物)失活。 hygr ：使潮霉素B失活。,阅读质粒图谱,第三步：看多克隆位点（MCS）它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳

6、定，转化效率越低。,合格质粒的组成要素,1、复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 2、抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ 3、多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 4、P/E 启动子/增强子 5、Terms 终止信号 6、加poly(A)信号 可以起到稳定mRNA作用,载体选择,1、构建DNA重组体的目的，选择合适的克隆载体/表达载体。 2、载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力。 （2）表达载体据受体细胞类型原核/真核/穿梭。 （3）对原核表达载体应该注意 3 点： 选择合适的启动子

7、及相应的受体菌； 用于表达真核蛋白质注意阅读框错位； 表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 3、载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。,克隆载体的必要性,基因工程中有克隆载体和表达载体，克隆载体可以在受体菌中大量复制，表达载体用于表达目的蛋白，那么实际应用中，我们的最终目的是要得到目的蛋白，克隆载体不能完成表达，有何用呢？ 表达载体是否有何缺陷不能整合克隆载体的功能？ 构建兼有克隆和表达双重功能的载体有何困难？ pcr产物直接酶切连接？,数量 1.克隆的目可用于各种文库的建立，比如人类基因组计划。 2.克隆载体没有表达所需

8、的各种片段，所以可以容纳更长的目的片段，即可以克隆足够长的基因，效率更高。 3.克隆载体可以使目的基因在宿主中低成本便捷的扩增 4.表达载体的目的多样化的用表达载体克隆基因不是不可以，实际工作中要考虑更多，因此更复杂。 质量 1.克隆载体便于稳定保存目的基因 2.克隆载体上有很多合适的酶切位点供选用 3.克隆载体提供验证，如测序的方法,一般的策略：将目的片段克隆于非常简单的克隆载体上，按照需要再亚克隆于可以满足各种要求的表达载体上。回答的不是很系统，如有问题可以继续来信讨论，希望对你有所帮助。 T/A 克隆载体可以直接克隆 PCR 产物，省去了两端加装识别位点的设计，可直接连接克隆载体。 已知

9、序列直接PCR产物连接表达载体是很少几率出错的，这样做实际上是为了实验结果的严谨。,PCR常见问题分析,实验常见问题及注意事项,酶切问题分析,连接注意事项,结果鉴定,无扩增产物,非特异性扩增,拖尾,假阳性,PCR常见问题分析,无扩增产物,模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短,原因,对 策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间,现象：正对照有条带，而样品则无；,非特异性扩增,现象：PCR

10、扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多,原因,对 策,重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数,拖尾,现象：产物在凝胶上呈Smear（弥散）状态。,M 1 2,模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多,原因,对 策,纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环

11、次数,假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况),原因：靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：空白对照出现目的扩增产物,对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,PCR产物纯化,PCR产物是否需要用凝胶纯化？ 如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。,确定DNA浓度： 1）marker说明上是否有标明条带的DNA浓度，如果有，那么根据电泳的条带亮度与marker亮度对比去估计DNA浓度 2）用分光光度计去测A260nm的OD值。如果测量OD值的话，你只要得到插入片段和载体的OD值比例关系就行了，因为具体计算的时候考虑的也只是比例而不是实际浓度。（载体片段和插入片段进行电泳的时候，能够看到清晰的条带。）,酶切问题分析,连接重要的注意事项： 1.载体总量 2.载体