《二代测序简介》PPT课件.ppt

1、,第二代测序技术简介，公司理念：毅新兴业以生命科学研究为本，致力于科学技术服务，为客户提供完美的科研平台2007年.基因组SNPs(包括芯片、massarray)第二代大规模测序病毒包装miRNA表达谱蛋白组血清多肽谱2DE液相色谱-质谱（散弹枪法（代谢组核磁共振液相色谱-质谱，自主仪器恒温金属浴梯度聚合酶链反应仪恒温振荡仪Squenom质谱仪SAI质谱仪飞行时间/飞行时间测序仪*波兰人g . 007，试剂自主研发液体蛋白磁珠印度国家银行试剂慢病毒核糖核酸干扰库MicroRNA研究干细胞研究，3，内容提纲，从桑格法到新一代测序技术第二代测序平台介绍第二代测序技术应用宏基因组学（宏基因组学(泛基

2、因组学（盘古基因组学)，关键基因组学技术，1975 -南方脱氧核糖核酸杂交技术，1977 -桑格链终止和无极生组合，吉尔伯茨化学脱氧核糖核酸测序方法，1980 -自动原位寡核苷酸合成仪，1985年-穆利斯在塞特斯发现聚合酶链反应，1992 - Affymatrix(福多思集团(第一个基因芯片1995年- ABIs第一个自动化的脱氧核糖核酸测序仪2006年-第二代脱氧核糖核酸测序仪2007年上市，超越了单分子测序技术，桑格方法，标记引物(1)序列反应(4)序列分离(4)序列读出，第一代自动脱氧核糖核酸测序仪，在ABI 3700上的96个毛细管上并行运行，第一代测序仪的局限性，生产量链端片段的耗时

3、分离很难产生基于大规模并行系统的电泳分离测序成本样品处理难以小型化，需要更快更便宜的测序技术，个人基因组计划，下一代测序的趋势，固体表面大规模和高通量扩增群集生成（桥或聚合酶链反应(乳液聚合酶链反应（珠上片段(原位测序通过链延伸序列通过连接合成脱氧核糖核酸聚合酶序列通过脱氧核糖核酸连接酶大规模并行处理阵列测序技术目标，陈竺，日本血吸虫基因组，人类全基因组测序的目标：1000美元/人2008年预测5年内实现，2006年年年底，美国X大奖基金会设立了基因组执政官X大奖，奖金高达1000万美元。这项大奖将颁给第一个能在10天之内，用不到100万美元的费用，完成100个人类基因组测序的团队。附加条件是

4、覆盖率不小于98%，误差不大于1/100000 bp。,下一代平台，具有可逆荧光终止子的通用照明/索莱克斯SBS，通过焦磷酸测序的GS FLX罗氏/454生命科学SBS，具有双碱基编码的固体ABI/SBL阿根考特，具有碱基编码的SBL丹纳赫运动下一代测序工作流程，片段库制备随机对端，第二代性能，罗氏/454生命科学基因组测序仪，罗氏/454工作流程，脱氧核糖核酸文库制备脱氧核糖核酸片段端修复不对称连接接头（一个生物素化(固定在链霉亲和素包被的磁珠上变性-模板脱氧核糖核酸文库纯化，乳化扩增模板脱氧核糖核酸通过杂交固定在引物包被的捕获珠上（每个珠上1个片段(热型扩增（正向引物是生物素化的(富含链霉

5、亲和素包被磁珠的扩增珠粒、罗氏/454工作流程、珠粒沉积每个微孔一个扩增珠粒随后是酶珠粒和包装珠粒酶珠粒硫化酶荧光素酶包装珠粒有助于将脱氧核糖核酸珠粒保持在微孔中，焦磷酸测序4个核苷酸顺序流入核苷酸掺入释放焦磷酸(PPi)硫酸化酶将PPi转化为三磷酸腺苷由荧光素酶水解产生光，焦磷酸测序，将PPi转化为三磷酸腺苷，使用三磷酸腺苷产生光，去除(d)NTPs和过量的三磷酸腺苷，罗氏/454用于测定均聚物区域重复多达100个循环，后acq处理从头测序重测序扩增子变异体分析，图像处理化学发光事件映射到为每个孔产生的孔流图碱基，罗氏/454生命科学基因组测序仪，速度快，一个测序反应耗时10个小时，获得10

6、0余万个读长和4-6亿个碱基对。测序读长最长，单个序列的读长更长，平均可达到400-500个碱基左右准确度高，读长超过400bp时，单一读长的准确性可以超过99%；一致性好，测序结果一致性超过99.99%；可以进行成对结束测序研究；功能强大的基因组分析工具Polonator G.007，Polonator系统是由乔治丘奇博士和他的研究小组发明，该系统使用了美国最先进试剂处理和检测的部件，采用了最敏感的检测设备，现在已发展成为一个包含多个基因组学应用领域的研究平台，并且承担了美国个人基因组计划的个人基因组测序任务Polonator G.007最大的优势在于开机运行成本低和Linux开放资源软件P

7、olonator G.007工作流程，配对末端文库制备：配对末端文库是将基因组脱氧核糖核酸打断后，与中间接头连接，再环化，然后用Mme1酶切，使中间接头两端各有30bp的碱基，再加上两端的接头，形成文库。乳液聚合酶链反应：在微反应器中加入测序模板、聚合酶链反应反应元件、微珠和引物，进行乳液乳液聚合酶链反应。微球富集和固定：聚合酶链反应完成之后，变性模板，富集带有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。将微珠沉积在一块玻片上，微珠上的模板经过3修饰，可以与玻片共价结合。连接反应测序：polonator连接反应的底物是9碱基单链荧光探针混合物。探针的5末端分别标记了CY5、德克萨斯红、CY3、6-FAM这

8、4种颜色的荧光染料。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链脱氧核糖核酸模板链配对，结合的探针就提供了一个荧光检测信号，最终被仪器识别。Polonator，G.007，数据量每次运行可以得到10Gb的高质量数据运行时间80小时读长30bp2，每次运行可以读取1.2 1.3109个磁珠准确性超过99%运行成本仅为目前二代测序系统运行成本的60%样品数/运行同时支持2 8道最多16个样品测序Illumina/Solexa-基因组分析仪Illumina基因组分析仪是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，它基于专有的可逆终止化学反应原理Illumina/Solexa工作流程、Solexa基因组分析仪，

9、测序通量高：每次运行后可获得30 GB的高品质过滤数据；简单、快速、自动化：制备样品文库可以在几小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数据；脱氧核糖核酸序列的读取长度不断增加，当前达到100 bp单个或配对末端支持：基因组分析仪系统支持单个片段或配对末端文库；每张芯片有8个通道，每个通道可单独测序一个样品，也可以把多个样品混合在一起测序ABI固体文库制备，剪切片段用接头(A1和A2)标记到每一端，ABI固体乳液聚合酶链反应，乳液聚合酶链反应使用文库中的脱氧核糖核酸片段在涂有一种引物的珠子(m)上进行，ABI固体珠沉积，在涂有接头主动脉第二声的聚苯乙烯珠上富集的扩增珠；任何含有延伸产物的珠粒将通过其P2末端结合聚苯乙烯珠粒。这将具有目标脱氧核糖核酸的珠子的生产量从30%增加到80% .富集产物的3个末端被修饰以允许共价连接到载玻片表面，荧光探针，通过连接的ABI固体序列，通过