基因工程 第七章 酵母基因表达体系(55P).ppt

1、酵母基因表达系统，发展过程1974年rlarckwalker和Miklos发现大多数酿酒酵母中存在质粒。 1978年Hmnen将来自一个酿酒酵母的leu 2基因导入另一个酿酒酵母中，弥补后者的leu 2缺陷，显示了酵母表达系统的确立。 1981年Hinnen等人在酵母基因表达系统中表达了人干扰素。 我国也是1983年首次在酵母菌中发现乙型肝炎病毒表面抗原基因。 1996年在全世界的科学家的协助下，完成了最初的真核生物酿酒酵母的全染色体组的序列决定。 酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统优势，安全无毒，无病原而有更明确的遗传背景，易于引入遗传操作的运载体DNA。 优化了DNA转化技术的发展，

2、许多酵母菌可以得到高转化率。 培养条件简单，容易高密度发酵5 .具有能把外来基因表达产物分泌细胞培养基中的类似高等真核生物的蛋白质翻译后修饰功能。 缺陷是表达效率相对较低2 .酵母的密码子偏差较多，真核基因在其中表达时需要人工修正。 酵母菌作为基因工程接纳体的特点，有酵母菌的基因工程、酵母菌表达外源基因的优势，全染色体组测序，基因表达调控反应历程较明确，遗传操作简便，可将外源基因表达产物分泌细胞培养基，有不可与原核细菌匹敌的真核蛋白质翻译后加工系统， 大规模发酵历史长、技术成熟、技术简单、成本低廉的美国FDA被认定为安全，基因工程接纳体系统(Generally Recognized As Sa

3、fe GRAS )，酵母菌为最简单的真核模式生物，酵母染色体组特点是与真核生物染色体组相比，啤酒酵母染色体组较小，有16条酵母细胞球可以作为单倍体存在，也可以作为二倍体存在。 这克服了在另一个真核生物中难以检测出隐性基因控制的形状的缺陷。 酵母菌的宿主系统是表达外源基因的酵母宿主菌提高重组异源蛋白的收率变异宿主菌抑制超糖基化作用的变异宿主菌4 .减少泛蛋白因子依赖型蛋白分解作用的变异宿主菌广泛应用于外源基因表达的酵母宿主菌目前广泛应用于外源基因表达的研究酵母菌如下： 巴斯德毕赤酵母表达外源基因是理想的，提高重组异源蛋白的收率的突然变异宿主菌可提高啤酒酵母中的异源蛋白的收率，抑制品质改善的突然变

4、异，抑制超糖基化作用的突然变异宿主菌的多种真核生物蛋白质在其天门冬酰胺侧链连接寡核苷酸，对蛋白质的生物活性影响很大。 整个糖单位由糖核心和外侧糖链两部分组成。 尽管酵母菌普遍具有完整的糖基化系统，但由于野生型酿酒酵母难以控制异源蛋白的糖基化反应，呈超糖基化趋势，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。泛蛋白因子依赖型蛋白分解作用的变异减少宿主菌泛素介导的蛋白分解作用，如果外源基因表达产物在酵母菌中对泛蛋白依赖型分解作用有易感性，可按以下方法使该分解作用最小化的第二种方法是在可诱导外源基因表达的启动子调控下， 由于异源蛋白短期集中表达，分子数绝对优势的表达产物可以逃脱泛蛋白因子的束缚，减少分解效果造成的损

5、失的第三种方法是，在使用泛蛋白因子的生物合成缺陷的变异株作为外源基因表达的接纳体细胞球的酿酒酵母中， 摇镜头蛋白因子的主要来源是多摇镜头蛋白基因UBI4的表达，虽然UBI4突变株能正常生长，但其细胞球内游离的摇镜头蛋白因子浓度远低于野生型菌株，因此该缺陷株是理想的外源基因表达接纳体。 查询密码泛蛋白激活酶催化剂e-1的基因也可以作为突然变异的靶基因，在包含该突变型基因的哺乳动物细胞球内，几乎没有检测出泛蛋白外来蛋白的共价键产物。 酿酒酵母查询密码E1蛋白的基因UBA1为留守基因，UBA1突变株致死性，但查询密码UBA1蛋白等位基因可减少泛素因子依赖性同源蛋白的降解作用。 另外，上述6个UBC基

6、因的变异也是建构重组异源蛋白稳定表达宿主系统的选择方案，广泛蛋白因子依赖型蛋白分解作用的变异宿主菌泛素分解途径衰减的酿酒酵母UBI4缺陷型：在酿酒酵母菌中，泛素主要在UBI4基因表达，UBI4变异株正常生长， 细胞球内游离泛素分子浓度低于野生株的UBA1缺陷型： UBA1查询密码万神庙活化酶催化剂E1、UBA1突变株的致死性，但其等位基因缺陷是非致死性的，也能减弱经万神庙的蛋白分解. Ubc4-ubc5双突变型： 7个泛素连接酶催化剂基因的突变对衰减蛋白分解作用也有效。 酵母菌运载体系运载体的一般结构选择标识牌复制子表达盒启动子序列终止子有用的蛋白结构域1酵母菌中的野生型质粒2酵母菌爱沙尼亚克

7、朗表达质粒的建构，酵母菌种的野生型质粒，酿酒酵母中的双环状质粒，大部分酿酒酵母含有双链环状质粒，复制数为50-100个Irs反向重复序列600bp、重组FLP查询密码产物驱动Irs的同源重组REP查询密码产物调控质粒的稳定性STB REP的结合位点结合酵母属中的pSRI、pSR1、pSB2和pSR1及克鲁维酵母属中的pKD1质粒等，具有类似的结构。 2u质粒，大多数酿造酵母菌株存在6318bp大小的野生型2u双链环状质粒，宿主细胞核内的复制数维持在50-100之间，呈核小体结构，其复制调控模式与染色体DNA完全相同。 2u质粒包含相互隔开的两个599bp长反复序列(IRs )，它们可在某些条件

8、下发生同源重组定，形成两种不同的形态(a和b )。 该质粒有4个基因： FLP、REP1、REP2和d中FLP基因的查询密码产物催化2个IRS序列之间的同源重组，使质粒以a和b 2种形态感受态，REP1、REP2和d基因就是调控质粒稳定性的反作用因子查询密码基因2u质粒还包含3个顺式作用元件，其中单个自主复制子结构(ARS )位于一个IRs的边界上，而REP3(STB )区REP1和REP2蛋白因子的结合位点在质粒的细胞球有丝分裂时的均匀分配中发挥重要作用，FRT在2个IRs序列中宿主细胞球内的极稳定性主要由两个因素决定：第一，2u质粒在细胞分裂时可将其复制副本分为母细胞球和子细胞球； 第二，

9、当细胞球中的质粒拷贝数由于某种原因减少时，2u质粒可通过自放大自动调节其拷贝数水平。 这些个2个复制特性均与FLP蛋白的作用密切相关，这是2u质粒在有限复制次数下可获得高拷贝的主要反应历程。 酵母菌种的野生型质粒、乳酸克鲁维酵母中的线状质粒、乳酸克鲁维酵母中含有2种不同的双点画线状质粒pGKL1和pGKL2，拷贝数为50-100个，分别具有K1和K2种能致死宿主细胞球的毒素蛋白基因。 酵母菌的运载体系统包括质粒载体整合运载体(integrating vector )人工染色体酵母质粒载体和酵母加性质粒(yeast episomal plasmid，YEp )酵母复制型质粒(yeast repl

10、icating plasmid ) 的3种YRp )酵母着丝粒质粒(yeast centromere plasmid，YEp )，酵母加成型质粒来源于野生型酵母质粒，该质粒存在于多种啤酒酵母株系，功能不良。 但一个重要特征是，该质粒被长约599bp的反复序列分为两个部分，每个部分含有一个启动子和在其启动子控制下的两个基因。 一个基因是FLP，查询密码位点特异性重组酶催化剂，该酶催化剂催化反复序列间的遗传重组。 酵母加成型质粒是在该质粒中加入酵母核DNA序列和大肠菌群pMB9的部分序列而成。 可以用酵母或大肠菌群复制。 酵母菌中天然存在的自主复制型质粒很少，且相当部分野生型质粒是隐蔽型的，因此目

11、前用于克隆复制和表达外源基因的运载体质粒可筛选野生型质粒和宿主染色体DNA上的自主复制子结构(ARS )、中心粒序列(CEN )、端粒序列(TEL )及感受态子在云同步中加入酵母染色体的自主复制序列。 该质粒一般不与酵母染色体重组，感受态酵母的转化率高，但不能稳定遗传。 酵母着丝粒：来自酵母染色体着丝粒周围的leu2和cdc10之间的1.6kb的序列。 具有这种着丝粒序列的质粒在酵母中的行为类似于微小染色体，可稳定遗传，均匀分配给子细胞球，同时在宿主细胞球中的拷贝数少。 但是含有着丝粒质粒的酵母细胞球生长非常慢，降低了细胞球的生存能力。 整合载体：由于不含酵母自主复制序列而不能独立复制到酵母中

12、的载体。 这样的运载体如果不编入酵母染色体，就不能稳定地表达其中所含的基因。 啤酒酵母含有3040个拷贝的可转移基因(Ty )，其结构包含2个长OFR和2个长末端重复序列(LTR )，Ty可整合到宿主细胞球的染色体上。 在Ty的OFR2的3端和LTR的3端之间插入外源基因，外源基因就可以和Ty一起合并到酵母染色体中。 酵母菌爱沙尼亚克朗表达质粒的建构，含ARS的YRp和YEp质粒及其建构ARS是酵母菌中的自主复制序列，大小为0.8-1.5Kb，染色体上每30-40bp有一个ARS元件。 染色体ARS组成的质粒称为Yrp，2质粒组成的杂质粒称为Yep。 两种这些个质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达

13、200个，但经过数代培养，质粒的丢失率可达50%至70%，主要是由于分配不均匀所致。 将酵母菌爱沙尼亚克朗表达质粒的建构、含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的建构、大肠菌群质粒整合酵母菌染色体DNA特定序列和标识牌基因，将建构质粒称为YIp。 目的基因表达盒通常被插入染色体DNA的鉴定、序列中，使目的基因能够有效地整合到酵母菌的特定染色体DNA区域中。酵母菌爱沙尼亚克朗表达质粒的建构、含CEN的YCp质粒的建构CEN是与酵母菌染色体DNA上染色体均匀分配有关的序列。 将CEN插入ARS质粒，得到的新运载体称为YCp。 YCp质粒的有丝分裂稳定性高，但拷贝数通常只有15个。 利用酵母菌爱

14、沙尼亚克朗表达质粒的建构、含TEL的YAC质粒建构酵母菌的端粒TEL.CEN.ARS等DNA元件可建构人酵母染色体，爱沙尼亚克朗放大大片段的外源DNA，这是建构YAC运载体的基本思路YAC运载体载货量高达800kb，人类基因组文库酵母菌的感受态系统、感受态质粒在酵母细胞球中的命运、酵母菌的感受态工艺、筛选感受态子的标识牌基因、酵母菌的感受态工艺、酵母菌的原生质体转化法初期酵母菌的转化全部采用等渗透缓冲液中稳定的原生质体转化法。 在Ca2和PEG的存在下，转化细胞可达到生存原生质体球总数的15%。 但是，操作周期长，而且转化效率受到原生质体再生率的严重制约。 原生质体感受态法的一个特点是一个接纳

15、体细胞球可以在云同步中容纳多个质粒分子，且经共感受态的原生质体占感受态子总数的25%至33%。 酵母菌经感受态计程仪普拉姆碱金属络离子的酵母菌完全细胞球的感受态酿酒酵母碱金属细胞球经碱金属络离子(如Li等)、PEG热休克处理后，可有效吸收质粒DNA，且吸收线性DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍。 共变换现象很少见。 酵母菌的感受态普拉姆酵母菌的电击感受态酵母菌原生质体和完全细胞球可在电击条件下吸收质粒DNA，但该过程中应避免使用PEG，对电击细胞球有很大的负面作用。 其优点是，不依存于接纳体细胞球的遗传特征及培养条件的适用范围广，转化率高，为105感受态子/gDNA。 酵母细胞球中

16、感受态质粒的命运单链DNA均可有效感受态酵母菌，但单链DNA的感受态率在含有双链10-30倍酵母复制子的单链质粒进入细胞球时，可正确感受态复制在双链上。 不含复制子的单链质粒进入细胞球，可有效同源整合到染色体上，对体内定点变异酵母染色体组极为有利。 同源重组频率取决于整合子型质粒和受体菌染色体组之间的同源程度和同源区的长度，一般整合子占感受态子总数的50-80%。 用于感受态子筛选的标记基因营养缺陷型互补基因酵母菌感受态子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因和显性基因两种。 营养缺陷型互补基因主要是氨基酸和核苷酸的生物合成记忆，如Leu、Trp、His、Lys、Ura、Ade。 但对多倍体酵

17、母来说，筛选营养缺陷型接纳体是非常困难的。 用于筛选感受态子的标识牌基因显性标识牌基因的查询密码产物，仅通过利用与质粒上的营养成分生物合成标识牌基因互补的营养缺陷型接纳体菌，就可在不添加任何筛选试剂的情况下维持感受态子中质粒的存在，但该筛选互补模式仍不稳定。 近年来发展起来的自选系统是克服上述困难的有效方法。 酿酒酵母的一种srb1突变株对环境条件极为敏感，只能在含有渗透压稳定剂的培养基中正常生长，而在通常的复合培养基中细胞球就会自发分裂。 用含有野生型SRB1基因的自主复制序列型多拷贝质粒感受态该突变株接纳体细胞球，可使只有感受态子在不含渗透压稳定剂的正常培养基中生长，从而在任何培养基中都能进行转化细胞的筛选和维持质粒的稳定。 更好的是，含有SRB1标记基因的多拷贝运载体可以稳定地复制到受体菌中80代以上。 该自选择系统对化学制剂和营养缺陷的互补筛选计程仪方案具有更高的应用价