微生物的生长及其控制刘.ppt

1、第六章 微生物的生长繁殖及其控制,生长微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。 繁殖生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。 个体生长微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。 群体生长群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）个体生长个体繁殖 群体生长 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖,生长与繁殖的概念,微 生 物 学,北方民族大学,6.1微生物生长的研究方法 6.1.1微

2、生物的培养 6.1.2微生物的同步生长及同步培养法 6.1.3微生物生长的测定 6.2微生物的群体生长规律 6.2.1典型生长曲线 6.2.2几个重要参数 6.2.3连续培养 6.3环境因素对微生物生长的影响 6.4微生物生长的控制,本章内容,微 生 物 学,北方民族大学,6.1 微生物生长的研究方法,一、微生物的纯培养及获得方法,稀释平板涂布分离法 稀释倒平板法 平板划线分离法 液体稀释法 单细胞（单孢子）分离法,常用分离、纯化微生物方法,6.1.1微生物的培养,为了进行纯培养，防止其它微生物的进入是很重要的，若其它微生物进入了纯培养中，便称之为污染。,北方民族大学,微 生 物 学,微 生

3、物 学,平板涂布分离法（Spread Plate）,先用固体培养基制成无菌平板,然后将一定稀释度的少量样品(一般是0.2_0.5ml)加到平板上,并用无菌玻璃涂棒将菌液均匀涂布到整个平板表面,经过培养后挑取单个菌落. 是最常用的方法.,简单易行，但易造成机械损伤,将待分离的材料用无菌生理盐水进行一系列稀释,然后取不同稀释液少许(一般是1ml)分别与已熔化并冷却到50左右的琼脂培养基混合倒入无菌平皿中,冷凝后进行培养.如果稀释得当,在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落,这样的菌落可能是由一个细胞繁殖而来的.随后挑取该单个菌落,或重复以上操作数次,就可得到纯培养.,稀释倒平板法（Pour

4、 Plate）,北方民族大学,微 生 物 学,用接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线 ，如果划线适宜，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。,平板划线分离法,微 生 物 学,平板划线分离法,特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）,微 生 物 学,首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物. 这种方法适合于细胞较大

5、的微生物.,液体稀释法,微 生 物 学,单细胞（单孢子）分离法,采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。,微 生 物 学,选择性培养分离法,为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。,利用选择培养基进行直接分离 富集培养,微 生 物 学,

6、试从相应样品中分离特定的微生物：,从土壤中分离褐球固氮菌,从酒样中分离酵母菌,从霉腐样品（水果、馒头、面包等）中分离霉菌,从土样中分离放线菌,试从实验目的、原理、实验方法（包括确定采集样地点、分离纯培养物方法、何种培养基等）、步骤及时间安排等几个方面设计分离相应的菌种。,二、微生物的培养方法,好氧培养,固体培养,实验室用琼脂作凝固剂,工业生产中则利用含水量适度的半固体物料作为培养基,液体培养,实验室中主要采用摇瓶培养法,工业上主要采用深层液体通气法,厌氧培养,实验室中（不管是液体厌氧培养还是固体厌氧培养）都需要特殊的培养装置,工业上主要采用液体静置培养方法,微 生 物 学,6.1.2微生物的同

7、步生长及同步培养方法,同步生长的概念：在培养物中所有微生物细胞都处于同一生长阶段，并都能同时分裂的状态，称为同步生长。进行同步分裂的细胞称为同步细胞。,由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。,同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。,同步培养法：能获得处于同一生长阶段的群体细胞的培养方法。,获得同步生长的方法（同步培养的方法）：,离心分离法,过滤分离法,硝酸纤维素滤膜法,获得同步生长的方法主要有两类： 环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。 机械法：选

8、择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。,机械法,硝酸纤维素滤膜 法：,原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。 步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。,微 生 物 学,评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；,客观地反映微生物生长的规律；,评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；,微生物生长的测定,6.1.3微生物生长的测定方法,微生物的生长繁殖及其控制,描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标。,一、微生物细胞

9、数目的测定法,直接法,血球计数板,涂片计数法,间接法,涂布平板法和倾倒平板技术,膜过滤法,（活菌计数法）,（死、活菌不分）,比浊法,微生物的生长繁殖及其控制,血细胞计数板,直接法血球计数板法,采用细菌计数板或血球计数板，显微镜下直接计数 （计算一定容积里样品中微生物的数量）。,缺点： 不能区分死菌与活菌； 需要相对高的细菌浓度.,用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。血细胞计数板是一块特制的厚载玻片，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。,大格 （计数室）,血细胞计

10、数板,计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小格（即16x25），另一种是一个大方格分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格（即2516）。,1大格=16中格 =16 X 25小格 =400小格,1大格=25中格 =25 X 16小格 =400小格,但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个，每一个大方格边长为1 mm，则每一个大方格的面积为1 mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1 mm3 。,计数时，如果使用1625的计数板，要按对角线方位取左上、左下、右上、右下上述4个中

11、格进行计数；如果使用2516规格的计数板，则除了计数上述4个中格外，还要计数中央的1个中格。分别按下述公式计算出酵母细胞数。,（1）1625格的血细胞计数板计算公式： 1 mL酵母细胞数=A/416104稀释倍数 （2）2516格的血细胞计数板计算公式： 1mL 酵母细胞数= A/525104稀释倍数,菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。 仪器：显微镜，血球计数板等。 其他：盖玻片，生理盐水，吸管，吕氏美蓝染液，擦镜纸，吸水纸等。,1.菌悬液的制备:稀释稀释程度以中格平均有1520个酵母为宜，可采用10倍系列稀释法。 2.镜检血细胞计数板：确证计数室上无污物或黏

12、附的微生物细胞后才可使用。 3.加菌悬液样品:盖上盖玻片吸管吹吸均匀吸取菌悬液（计数板一侧中间平台与盖玻片接触的边缘）滴一小滴菌液，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余菌液。,4.显微镜计数:加样后静止5 min置于显微镜载物台上先用低倍镜找到计数室所在位置然后换成高倍镜进行计数（计数时，对位于线上酵母菌，可采取只记数两条边的办法，当酵母菌芽体达到母细胞大小的二分之一时，可记作两个细胞）。,注意事项,5.计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用电吹风吹干。,1.计数室内不可有气泡,否则将影响菌悬液随机分布而使计数产生误差。 2.为了减少误差

13、，应避免计数时的重计或遗漏。 3.直接镜检计数完毕，用蒸馏水冲洗计数板。洗后待其自行凉干，或用电吹风吹干。,直接法 涂片染色法,应用：可同时计数不同微生物的菌数，适 于土壤、牛奶中细菌计数。 方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取 0.01ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代 入公式： 每ml原菌液含菌数 =视野中平均菌数涂布面积/视野面积100 稀释倍数,微 生 物 学,直接法 比浊法,原理:在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。,特点：快速、简便；但易受干扰。,微

14、生 物 学,间接计数法(活菌计数)平板菌落计数法,微 生 物 学,间接计数法(活菌计数) 薄膜过滤计数法,常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。 将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,微 生 物 学,测生长量重量法,二、测生长量,将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105、100或80)、称重。一般干重为湿重的10%20%，而一个细菌细胞一般重约10-1210-13g。 该法适合菌浓较高的样品。 举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10121013g，液体培养

15、物中细胞浓度达到2109个/ml时，100ml培养物可得1090mg干重的细胞。,以生物量为指标测定微生物的生长,重量法 生理指标法（碳、氮含量法，其它生理指标）,微 生 物 学,测生长量生理指标法,测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。 其他方法 含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。,微 生 物 学,6.2 微生物的生长规律,6.2

16、.1单细胞微生物的典型生长曲线,生长曲线定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线。,无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌， 其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的。,以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结论也基本适用于酵母菌。,生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。,微 生 物 学,将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测细菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌细胞数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。,生长曲线的制作,微 生 物 学,典型的生长曲线 （Growth curve）

17、,延滞期,指数期,稳定期,衰亡期,时期的划分：按照生长速率常数（growth race constant）不同,单位时间内分裂的次数（R）,现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。 特点： 生长速率常数R= 0; 细胞形态变大或增长; 细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强; 合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶; 对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等理化因素）. 原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物,延滞期（lag phase）,其它名称：停滞期、调整期、适应期,菌种 ： 繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短； 接种物菌龄 ： 用

18、对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期； 接种量：一般来说， 接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用种子:发酵培养基=1:10,v/v的接种量）； 培养基成分： 在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。,影响延迟期长短的因素：,认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：,在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期； 采取的缩短lag phase 的措施有： 增加接种量； （群体优势-适应性增强） 采用对数生长期的健壮菌种； 调整培养基的成分，在种子

19、培养基中加入发酵培养基的某些成分。 选用繁殖快的菌种 在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌,微 生 物 学,现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。 特点： 生长速率常数最大，即代时最短； 细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致； 酶系活跃，代谢最旺盛. 菌种 营养成分 营养物浓度 培养温度,指数期（logarithmic phase）,影响因素：,微 生 物 学,由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄； 是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料; 发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度; 食品工业上尽量使有害微

20、生物不能进入此期.,应用意义：,微 生 物 学,稳定期（stationary phase）,特点： 新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。 细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。 此时期的微生物开始合成次生代谢产物，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。 产生原因： 营养物尤其是生长限制因子的耗尽； 营养物的比例失调，如碳氮比不合适; 有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）； 物化条件（pH、氧化还原势等）不合适。,又称：恒定期或最高生长期,微 生 物 学,1）对以生产菌体或与菌体

21、生长相平行的代谢产物为目的的某些发酵生产来说，稳定期是产物的最佳收获期（即稳定期细胞数目及产物积累达到最高） ； 2）通过对稳定期到来原因的研究，还促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建。如补充营养物质（补料）；调pH；调整温度等 3）对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定来说，稳定期是产物的最佳收获期。,概念：表示微生物对基质利用效率的高低 Y=菌体干重/ 消耗营养物质的浓度,应用意义：,生长产量常数（Y，或生长得率，growth yield）：,如：Y=0.5，表示要得到5g菌体，需某营养物（葡萄糖）10g。,根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量,衰亡期（decline pha

22、se）,特点： 细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”。 细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。 因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。 衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。 产生原因： 生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡,微 生 物 学,微生物的生长曲线，反映一种微生物在一定的生活环境中（如试管、摇瓶、发酵罐）生长繁殖和死亡的规律。它既可作为营养物和环境因素对生长繁殖影响的理论研究指标，也可用为调控

23、微生物生长代谢的依据，以指导微生物生产实践。 根据发酵目的的不同，确定在微生物发酵的不同时期进行收获，微生物生长曲线可以用于指导微生物发酵工程中的工艺条件优化以获得最大的经济效益。,生长曲线的指导意义:,微 生 物 学,生长的数学模型,任何一数学公式所表示的数学关系，只要能反映客观物质的运动规律，都可视其为数学模型。利用数学公式来表达微生物系统的某些定量关系，该数学公式便是此系统的数学模型。 指数生长期中微生物生长是平衡生长，即微生物细胞数量呈指数增加和细胞各成分按比例增加。因此指数生长期中微生物的生长可用数学模型表示： dN/dt=N N：每毫升培养液中细胞的数量； ：比生长速率，即每单位数

24、量的细胞或物质在单位时间（h）内增加的量； t：培养时间（h）,微 生 物 学,对dN/dt=N积分，得lnNt-lnN0= (t1-t0) 将上式转换成以10为底的对数：,(t1-t0),lgNt-lgN0=,2.303,例如： t0时每毫升培养液中细胞数为104（N0），经过4h培养后该培养液中细胞数量增加到每毫升108（Nt），则此条件下该菌的比生长速率为：,=,lgNt-lgN0,t1-t0,2.303,=,8-4,4,2.303,/h =2.303 /h,说明该菌在此条件下,每个微生物细胞以每小时增加2.303个细胞的速度增加,微 生 物 学,指数生长可以用下式表示： Nt= N02

25、n Nt ,N0 和 t 可由试验获得， n 可通过 上式计算得出，将等式两侧取对数得： lg Nt = lg N0 + nlg2,式中： N0为起始细胞数目， Nt为指数生长某个时刻t时的细胞数目， n 为世代数,指数期繁殖代数 n,6.2.2单细胞微生物的群体生长的主要参数,由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时（eneration time, G ），代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需 时间，有时也称为倍增时间。,右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况。右图可见，每经过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是单细胞群体生长

26、的特征。,G t / n,代时：,微 生 物 学,例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000个（ B ），经4h （ t ）后增加到49，000，000个（ b ）， 这样， n (lg4.9107lg1.2104）0.30112,借助于 n 和 t ，还可以计算出不同培养条件下的代时G， G t / n 在本例中， G 460 / 12 20min 该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。,微 生 物 学,大肠杆菌在37的牛奶中每12.5min繁殖一代，假设牛奶消毒后，大肠杆菌的含量为1个/100ml，请问按国家标准（30000个/ml），该消毒牛奶在37下最多可存放多少时

27、间？,=,n,lg Nt,- lg N0,lg2,G / n,lgNt-lgN0,t1-t0,=,t1-t0,lg2,n,=,lg3000000,- lg 1,0.301,12.5,=,269min,=,4.5h,代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。 代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为13h,然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种

28、的一个重要特征。,微 生 物 学,生长速率常数R,单位时间内繁殖的代数,R=,1,G,迟缓时间T 微生物在生长过程中，在实际条件下达到指数期所需时间与理想条件（即无迟缓期）下达到指数生长期所需时间之差。,微 生 物 学,作用方式：影响微生物的生长速率和总生长量 生长限制因子：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物就称生长限制因子,细胞数或菌体量,单位数量微生物细胞或物质在单位时间内增加的量,比生长速率,= m（S/(Ks+S)）,基质浓度很小时，比生长速率和基质浓度成正比 基质浓度很大时，细菌以最大比生长速率生长,莫诺经验公式:,Monod公式只适用于单个限制性营养物质的情况

29、。,6.2.3连续培养（continuous culture）,分批培养（batch culture） ：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。 连续培养（continuous culture） ：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。 连续培养理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。,微 生 物 学,原理：当微生物在单批培养方式下生长达到指

30、数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。,一、连续培养原理,微 生 物 学,连续 培养器,按控制方式分 按培养器的级数分 按细胞状态分 按用途分,内控制（控制菌体密度）：恒浊器 外控制（控制培养液流速、以控制生长速率）：恒化器,单级连续培养器 多级连续培养器,一般连续培养器 固定化细胞连续培养器,实验室科研用：连续培养器 发酵生产用：连续发酵罐,二、连续培养器的类型,微 生 物 学,连续培养技术恒化连续培养,概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法

31、。 原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等） ，使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。 特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。 应用范围：实验室科学研究,微 生 物 学,恒化器Chemostat 或bactogen,概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。 原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速

32、。 特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。,连续培养技术恒浊培养,使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。,微 生 物 学,恒浊器与恒化器的比较,微 生 物 学,连续发酵（continuous fermentation）的优缺点,连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。 优点： 高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作； 自控：便于利用各种仪表进行自动控制； 产品质量稳定 节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。 缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养

33、物利用率低于单批培养。 连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月 1年。,微 生 物 学,微生物与所处的环境之间具有复杂的相互影响和相互作用：一方面,各种各样的环境因素对微生物的生长和繁殖有影响，另一方面,微生物生长繁殖也会影响和改变环境。研究环境因素与微生物之间的关系，可以通过控制环境条件来利用微生物有益的一面,同时防止它有害的一面。,6.3 环境因素对微生物的影响,影响微生物生长的外界因素很多，除了前面讲过的营养因素之外，还有许多物理化学条件。 本节主要内容： 一、温度对微生物生长的影响 二、氧气对微生物生长的影响 三、pH值对微生物生长的影响,温度是影响微生物生长的最重要因素之

34、一。 温度对微生物的影响具体表现在： 影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞物质合成。 影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。 影响物质的溶解度，对生长有影响。,6.3.1温度对微生物生长的影响,从微生物整体来看: 生长的温度范围一般在-10 100 极端下限为-30 ，极端上限为105150 但对于特定的某一种微生物： 只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度,处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。 超过最低生

35、长温度时，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡。 超过最高生长温度时，微生物不生长，温度过高，甚至会死亡。,一、微生物生长的三个温度基点,根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为三个类型：,二、微生物生长温度类型,低温型微生物（嗜冷微生物） 中温型微生物（嗜温微生物） 高温型微生物（嗜热微生物）,微 生 物 学,菌 名生长温度发酵温度累积产物温度 （ ） （ ） （ ） 嗜热链球菌 374737 乳酸链球菌3440产细胞：2530 产乳酸：30 Streptomyces griseus3728_ Corenybacterium pekinense32 3335_ Clostridium a

36、cetobutylicum3733_ Penicilium chrysogenum302520 以青霉素的生产为例：培养165小时采用分段控制温度的方法，其青霉素产量比始终在30 培养提高了14.7%。 分段控制方式：05小时，30 ；540小时，25 ；40125小时，20 ；125165小时，25 。,不同生理生化过程的最适温度,微生物不同生理活动要求不同温度，所以， 最适生长温度 发酵速率或累积代谢产物最高时的培养温度。,微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群:,6.3.2氧气对微生物生长的影响,专性好氧菌:,微好氧菌：,耐氧厌氧菌：,

37、(专性)厌氧菌：,好氧菌,兼性厌氧菌,厌氧菌,氧浓度对不同微生物生长的影响,专性好氧菌（strict aerobe）,必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧化物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）和过氧化氢酶。,在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。,微好氧菌（microaerophilic bacteria）,只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能，,兼性好氧菌（facultative aerobe）,耐氧菌

38、（aerotolerant anaerobe）,可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。,厌氧菌（anaerobe）,分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气或含有10%CO2的空气中，在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死，而是由于不能解除某些氧代谢产物的

39、毒性而死亡。 在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，例如，过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（ O2-）等。超氧阴离子为活性氧，兼有分子和离子的性质，反应力极强，极不稳定，可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死。 好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等， 而严格厌氧菌缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死。,厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说：,各类菌所含对氧解毒酶,专性好氧菌 SOD，过氧化氢酶 兼性厌氧菌 SOD， 过氧化氢酶 专性厌氧菌 二种酶均无 微好氧菌 少量SOD 耐氧菌 SOD， 过氧化物酶,H2O + O2

40、 2 O2 + 2H+O2 + H2O2 2H2O,1 2,SOD 好氧生物 和耐氧细菌,O2 + eO2 ( O2 ) 超氧阴离子在细胞内可由酶促或非酶促形成。 超氧物阴离子歧化酶是在生物进化中发展出来的一种自我保护方式。 兼性厌氧菌E.coli在发生SOD缺失突变后，就会变成一种“严格厌氧菌”。,生物体中超氧阴离子的形成与去除,过氧化氢酶 好氧生物,过氧化物酶 NADH2NAD 耐氧菌,在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施保证不同微生物的生长。 培养好氧微生物：需震荡或通气，保证充足的氧气。 培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气，同时 在培养基中添加还原剂，降低 培养基中的氧化还原

41、电位势。 培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。,影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力。 改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径：如：酵母菌在pH4.5-5产乙醇，在 pH6.5以上产甘油、酸。 环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收，或有毒物质的毒性。,6.3.3 pH值与微生物生长的相互影响,一、环境pH值对微生物生长的影响,微生物的生长pH值范围极广，从pH8都有微生物能生长。但是绝大多数种类都生活在pH5.09.0之间。 微生物生长的pH值三基点： 各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生

42、长受抑制或导致死亡。 不同的微生物最适生长的pH值不同，根据微生物生长的最适pH值，将微生物分为： 嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌 耐碱微生物：许多链霉菌 中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌 嗜酸微生物：硫杆菌属 耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌,二、 不同微生物对pH要求不同,微生物 pH值 最低 最适 最高 Thiobacillus thiooxidans 氧化硫硫杆菌 0.5 2.03.5 6.0 Lactobacillus acidophilus 嗜酸乳杆菌 4.04.6 5.86.6 6.8 Rhizobium japonicum 大豆根瘤菌 4.2 6.87.0 11

43、.0 Azotobacter chroococcum 圆褐固氮 4.5 7.47.6 9.0 Nitrosomonas sp. 硝化单胞菌 7.0 7.88.6 9.4 Acetobacter aceti 醋化醋杆菌 4.04.5 5.46.3 7.08.0 Staphylococcus aureus 金黄葡球菌 4.2 7.07.5 9.3 Chlorobium limicola 泥生绿菌 6.0 6.8 7.0 Thurmus aquaticus 水生栖热菌 6.0 7.57.8 9.5 Aspergillus niger 黑曲霉 1.5 5.06.0 9.0 一般放线菌 5.0 7.08

44、.0 10.0 一般酵母菌 3.0 5.06.0 8.0,不同微生物的生长pH值范围,同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对pH值的要求也不同。在发酵工业中，控制pH值尤其重要， 举例：Aspergillus niger在pH22.5范围时有利于合成柠檬酸，当在pH2.56.5范围内时以菌体生长为主，而在pH7.0时，则以合成草酸为主。 丙酮丁醇梭菌在pH5.57.0范围时，以菌体生长为主，而在pH4.35.3范围内才进行丙酮丁醇发酵。 微生物 生长最适pH 合成抗生素最适pH 灰色链霉菌6.36.96.77.3 红霉素链霉菌6.67.06.87.3 产黄青霉6.57.26.

45、26.8 金霉素链霉菌6.16.65.96.3 龟裂链霉菌6.06.65.86.1 灰黄青霉6.47.06.26.5,生长的最适pH值与代谢产物合成的最适pH值,三、微生物细胞内的pH值,虽然微生物生活的环境pH值范围较宽，但是其细胞内的pH值却相当稳定，一般都接近中性。 这种维持细胞内稳定中性pH值的特性能够保持细胞内各种生物活性分子的结构稳定和细胞内酶所需要的最适pH值。微生物胞内酶的最适pH值一般为中性，胞外酶的最适pH值接近环境pH值。,四、微生物的生命活动对环境pH值的影响,培养过程中调节pH值的措施 过酸时：加入碱或适量氮源，提高通气量。 过碱时：加入酸或适量碳源，降低通气量。,配

46、制培养基时调整pH值的措施：,微生物是一把双刃剑,6.4 微生物生长繁殖的控制,微生物会造成哪些危害？ 食品与工农业产品的腐败变质 污染：实验室、发酵工业 致病菌,杀灭 灭菌：杀菌溶菌 消毒：仅杀死病原菌 抑制 防腐：抑制霉腐微生物 化疗：抑制宿主内的病原菌,控制有害微生物的基本概念,灭菌：采用强理化因素使物体内外的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。 无菌：不存在活菌。 无菌操作：采取防止一切微生物进入某一范围的方法。多指微生物实验和外科手术的操作过程。,（一）灭菌,消毒：采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部病原微生物的方法,并不一定能杀死含芽孢的细菌或非病原微生物。 用以消毒的化

47、学药物称为消毒剂。 方法：70酒精消毒、巴氏消毒法等,（二）消毒,防腐：采用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，即通过抑制菌作用防止食品、生物制品等发生霉腐的措施。,（三）防腐,低温： 利用4以下的各种低温以保藏食物、药品、菌种等。 缺氧： 在密闭容器中加入除氧剂，如铁粉。真空保藏也是比较常用的方法。 干燥： 采用晒干或红外线干燥保藏粮食、食品等，或在密封条件下用吸湿剂也可达到防霉作用。 高渗：通过盐渍或糖渍达到高渗。 高酸度：如泡菜、酸菜等。 防腐剂：苯甲酸、山梨酸、脱氢醋酸等,防腐的措施,化疗：利用具有高度选择毒力即对病原菌具高度毒力而对其宿主基本无害的化学物质来抑制宿主体内病原微生

48、物的生长繁殖，借以治疗该宿主传染病。 化学治疗剂：磺胺类、抗生素、生物药物素若干中草药中有效成分等。,（四）化疗,高温灭菌（消毒）法是最常用的物理方法。高温可引起蛋白质、核酸等活性大分子氧化或变性失活而导致微生物死亡。,6.4.1常用控制微生物生长繁殖的物理因素,一、温度,干热灭菌法（dry heat sterilization） 焚烧法（incineration）：是将被灭菌物品在火焰中燃烧，使所有的生物质碳化。简单、彻底，但对被灭菌物品的破坏极大。适用于无经济价值的物品灭菌，及不怕烧的实验器具，如接种环、镊子、试管或三角瓶口的灭菌等。 干燥热空气灭菌法(hot-air oven)：将物品放

49、入烘箱内，然后升温至150170 ，维持12小时。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌，不适合液体样品，及棉花、纸张、纤维和橡胶类物质的灭菌。 特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温度高、时间长。,湿热法(moist heatsterilization) ： 特点：温度低、时间短、灭菌效果高 原因： 1) 菌体内含水量越高，则凝固温度越低； 2) 蒸汽冷凝会放出潜热； 3) 饱和水蒸汽穿透力强； 4) 湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主要破坏氢键结构。,高压蒸汽灭菌法 利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到100 以上高温灭菌的方法。 方法：121（1kg/cm

50、2或15磅/英寸2）维持15-20min。 112（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min。 115（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-30min。 应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度 例如：生理盐水、营养琼脂等培养基用121 。 含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基用112 。 适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。,高 压 蒸 汽 灭 菌 锅,注意事项： 排净冷空气； 灭菌终了，缓慢降压； 灭菌结束，趁热取出物品。,高温对培养基的影响及其防止措施,高温对培养基的不利影响： 会产生混浊或形成不溶性沉淀 营养成分被破坏（ PO4-3存在，葡萄糖生成酮糖，菌不利用）

51、； 色泽加深（褐变如产生氨基糖等）； 改变培养基的pH值（通常下降0.2） ； 形成有害物质，抑制微生物生长； 消除有害影响的措施 采用特殊的加热灭菌法 过滤除菌法 加入螯合剂,煮沸消毒法 将水加热至100，煮沸15min30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物的目的。 巴斯德消毒法（Pasteurization）： 用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食品的营养风味，又进行了消毒 该法一般是将待消毒的液体食品置于62处理30min，然后迅速冷却。即可达到消毒目的。 低温长时法(Low temperature long time,LTLT)；62.930min处理牛奶 高

52、温瞬时法（Hightemperatureshorttime,HTST):71.615s处理牛奶 超高温巴斯德灭菌法(Ultrapasteurization):让液体食品停留在140左右3-4s，急剧冷却至75，经匀质化后冷却至20。,间歇灭菌法： 将待灭菌物品在80-100蒸煮15-60min，冷却后搁置室温（28-37）下过夜，并重复以上过程三遍以上。 其蒸煮过程可杀死微生物的营养体，但不能杀死芽胞，室温过夜促使残留的芽孢萌发成营养体，再经蒸煮过程可杀死新的营养体；循环三次以上可保证彻底灭菌的目的。 适用于不耐高温的物品灭菌，如不适于高压灭菌的特殊培养基、药品的灭菌。 缺点是麻烦、费时。,影

53、响加压蒸汽灭菌效果的因素,高压蒸汽灭菌器中温度与压力的关系,灭菌锅内空气的排除程度验证,灭菌锅上同时装有压力表和温度计 将待测气体通过橡胶管引入深层冷水中 灭菌后知道：在灭菌后要知道当时的灭菌温度是多少，可在灭菌的同时，采取以下方法进行验证： 1、放入耐热性较强的试验菌种嗜热脂肪芽孢杆菌，灭菌后，在适宜的培养基中进行培养，看它是否被杀死； 2、放入硫磺(熔点115)、乙酰替苯胺(116) 或脱水琥珀酸(120)等结晶，看其是否熔化等。,低温低温是通过降低酶反应速度使微生物生长受到抑制。 冷藏法：5，微生物斜面菌种放置冷藏箱中可保存数周至数月而不衰竭死亡；食品保鲜 冷冻法：食品工业中采用-10左

54、右的冷冻温度较长时间地保藏食品；冷冻法也可用作菌种保藏，但所需温度更低，如-80低温冰箱、或-78干冰、或-80液氮中冷冻保存。,低温抑菌,采用滤孔比细菌还小的筛子或滤膜作成各种过滤器，当空气或液体流经筛子或滤膜时，微生物不能通过滤孔而被阻留在一侧，从而达到灭菌的目的。但不能除去病毒。 实验室中常用的滤器： 滤膜过滤器、蔡氏过滤器、玻璃过滤器、磁土过滤器等。 过滤介质：醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜； 以及石棉板、烧结陶瓷、烧结玻璃等。 滤器孔径：常用0.22 m 、0.45 m 。 应用：对于含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质除菌。,二、过滤除菌法,水活度：在相同的温度、压力下，体系

55、中溶液的水的蒸汽压与纯水的蒸汽压之比,即a=p/p0. 微生物生长的水活度范围 ： a=0.630.99 各种微生物生长的最低水活度值,三、水分,渗透压和干燥都涉及到水分含量和水活度，它们对微生物的生长都有很大的影响。 干燥抑制微生物生长或造成其死亡的原因： 干燥能引起微生物细胞内蛋白质的变性和盐类等物质浓度提高，从而抑制生长或造成微生物死亡,干燥对微生物的影响:,细胞内溶质浓度与胞外溶液的溶质浓度相等时，为等渗溶液,溶液的溶质浓度高于胞内溶质浓度为高渗溶液,溶液的溶质浓度低于胞内溶质浓度为低渗溶液. 在等渗溶液中,微生物的活动保持正常,细胞外形不变 在高渗溶液中,细胞易失水,脱水后发生质壁分

56、离,生长受抑制或死亡.(盐渍和糖渍保藏食品) 在低渗溶液中,细胞吸水膨胀,甚至导致细胞破裂死亡.,渗透压对微生物的影响,细菌中的嗜盐菌： 能在15%30%的盐溶液中生长，主要分布在盐湖、死海、海水和盐场及腌渍菜中。又分为： 低嗜盐菌：能在2%5% 盐溶液中生长 中嗜盐菌： 5%20% 极端嗜盐菌： 20%30% 高糖环境下生长的微生物： 花蜜酵母菌和某些霉菌能在60%80% 的糖溶液中生长 产甘油的耐高渗酵母能在20%40%的糖蜜中生长,微生物对干燥的抵抗力与以下因素有关： 温度： 在相同的干燥环境下，温度高，微生物易死亡， 而在低温下不易死亡（例如冷冻干燥保藏菌种） 干燥速度：干燥速度快，微

57、生物不易死亡，反之，易死亡 基质：在不同基质中对干燥的抵抗力不同，含有糖、淀粉、蛋白质等物质时，不易死亡。 微生物种类及生长时期：产荚膜菌比不产荚膜菌抗性强；小型、厚壁细胞的微生物比长型、薄壁细胞的微生物抗性强；细菌的芽孢、真菌的孢子比营养细胞抗干燥性很强；老龄菌比幼龄菌抗性强。,辐射：是能量通过空间传递的一种物理现象。 与微生物有关的辐射： 电磁辐射：可见光、紫外光， 电离辐射：、射线 。,四、辐射,可见光： 波长在400800nm的电磁辐射为可见光。 大部分微生物不需要光，少数菌需要光作为能源。 一般来讲，可见光对大多数化能微生物没有影响，但是，太强或连续长时间照射也会导致微生物死亡（光氧

58、化作用）。,电磁辐射：,波长在100 400nm的电磁辐射为紫外线。 紫外线杀菌或诱变原理： 紫外线作用于DNA ，使其产生胸腺嘧啶二聚体，引起DNA结构变形，阻碍正常的碱基配对，从而造成微生物变异或死亡。 紫外线会使空气中的分子氧变成臭氧，臭氧释放的原子氧有杀菌作用。 其中波长在260 280nm处的紫外线杀菌力最强。主要因为核酸（DNA、RNA）的吸收峰为260nm，蛋白质的吸收峰为280nm。,紫外线（）,光复活现象：经紫外线照射的微生物，在可见光下，光可以激活DNA修复酶，该酶能修复DNA上的损伤，使微生物的突变率或死亡率下降。 微生物对紫外线的抵抗力与以下因素有关： 照射时间：照射时间长，死亡率高。 照射强度：照射强度大，死亡率高。 微生物种类及生长阶段：革兰氏阳性菌比阴性菌抗性强；多倍体比单倍体抗性强；孢子和芽孢比营养细胞抗性强； 干燥细胞比湿润细胞抗性强。 应用：由于穿透力差，只适用于物体表面以及空气、水的消毒杀菌，也用于诱变育种。,、射线 ，波长短，能量高，有较强的杀伤力。 作用原理 ：可引起水和其他物质的电离，产生游离基，使核酸、蛋白质或酶发生变化，造成细胞损伤或死亡。 特点：穿透力强，非专一性，作用于一切细胞成分，对所有生物均有杀伤作用。 应用：用于杀菌或菌种诱变。,电离辐射：,微波：微波的范围在9152450MHz/s之间。 机理：微波产生热效应，