3. 糖链结构测定及糖的提取分离.ppt

1、分子量及分子式的测定 质谱分析测定分子量和分子式。 苷类化合物一般极性较大，无挥发性，遇热气化时易于分解，采用电子轰击质谱(EIMS)常常不能获得分子离子峰。 现多采用化学电离质谱(CI-MS)、场解吸质谱(FD-MS)、快原子轰击质谱(FAB-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)等方法来获得分子离子蜂，尤其是ESI-MS及FAB-MS两种质谱法更是目前测定苷类分子量常用的方法。,七、糖链结构的测定,组成苷的苷元和单糖的鉴定 将苷用稀酸或酶进行水解，使生成苷元和各种单糖 苷元的结构鉴定 在有关章节中逐一介绍。 组成苷中糖的种类鉴定 通常采用PC、TLC等方法对水解液进行鉴定。 糖类的PC常用的展

2、开剂大多为含水的溶剂系统，如正丁醇-醋酸-水(4:1:5)，EtOAc-吡啶-水(2:1:2)等，其Rf值与溶剂的含水量有关。,七、糖链结构的测定,苷中糖的数目的测定 质谱：苷分子量-苷元分子量，求出糖的数目。 核磁：氢谱中端基质子信号数(5ppm左右)，碳谱中端基碳信号的数目(90-112ppm)。,七、结构的测定,苷元和糖之间连接位置的确定 13C-NMR：苷化位移规律，将苷和苷元的碳谱相比较。 成苷后，-C约+8ppm,-C约-4ppm 二维核磁共振谱(如HMQC COSY及HMBC谱)等技术广泛用于确定连糖位置。,七、结构的测定,糖与糖的连接位置的确定 全甲基化物进行甲醇解，分析其甲醇

3、解产物。,七、糖链结构的测定,采用的方法通常是将这些甲醚化的单糖进行了TLC鉴定，并与标准品对照。近来亦有用GC-MS联用仪对其进行鉴定的报道。 全甲基化甲醇解：,七、糖链结构的测定,七、糖链结构的测定,如：已知某二糖甲醇解后得到下列产物， 请推测该二糖的结构（连接位置）,全甲基化甲醇解,甲基化反应 (1)Haworth法：用硫酸二甲酯和氢氧化钠(或碳酸钠、碳酸钾)，可使醇羟基甲基化。其缺点是甲基化能力较弱，如果欲进行全甲基化反应，必须进行多次反应才能达到目的， (2)Purdie法：用碘甲烷和氧化银为试剂(一般可在丙酮或四氢呋喃中进行)，可使醇羟基甲基化，但因氧化银具有氧化作用，只能用于苷的

4、甲基化而不能用于还原糖的甲基化。,七、糖链结构的测定,(3)Kuhn改良法：在二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，加入碘甲烷和氧化银或硫酸二甲酯及氢氧比钡(或氧化钡)，在搅拌下进行甲基化。本法的缺点是反应较缓慢。 (4) Hakomari法(箱守法)：二甲基亚砜(DMSO)，氢化钠，碘甲烷,七、糖链结构的测定,此法反应迅速、完全、无需特殊装置、可在室温下连续反应，是目前最常用的全甲基化方法。但因在反应中，所用二甲亚砜和NaH均呈强碱性，故分子中有酯键的苷类不宜用本法。,七、糖链结构的测定,酶水解 转化糖酶-水解-果糖苷键 麦芽糖酶-水解-葡萄糖苷键 杏仁苷酶-水解-葡萄糖苷键,专属性较低 纤维素酶-

5、水解-葡萄糖苷键 NMR谱法测定 利用端基质子的偶合常数 如：5ppm(1H, d, J=7Hz)为下面哪个结构？,七、糖链结构的测定-苷键构型的确定,一 、提取 植物体内，苷类常与水解该苷的酶共存。 提原生苷：先杀酶。 常用的方法是在中药中加入CaCO3,或用甲醇、乙醇或沸水提取，同时提取过程中要尽量勿与酸或碱接触，以免苷类分解。 提苷原：可利用酶活性,八、糖及苷类的提取和分离,八、糖及苷类的提取和分离 化合物的极性,功能基的种类：(-COOH) (-OH) (C=O) (-COOR) -O- (-CnHm) 极性功能个数 分子内氢键降低极性 化合物大小 小分子的极性大于大分子的极性,常用溶

6、剂极性： 水 甲醇 乙醇 丙酮 乙酸乙酯 氯仿 乙醚 己烷 H2OMeOHEtOHCH3COCH3 EtOAcCHCl3EtOEtCH3(CH2)4CH3,流程图,八、苷类的提取和分离,糖和苷的提取分离,药材,水,水提液,3倍量以上乙醇,醇水溶液,沉淀,（苷）,（多糖）,多糖提取分离（一）提取 水提得到的粗多糖水溶液，加入95%乙醇使含醇量达80%，4摄氏度静置过夜，多糖析出。减压抽滤，用95%乙醇洗至溶液无色。沉淀（多糖）挥干醇。（二）除蛋白 这是至关重要的一步，由于蛋白是大分子，它的存在会干扰多糖的纯化。一般选用sevage法萃取或离心，多糖浓度为1mg/ml, 氯仿-正丁醇比例通常在3:

7、1-5:1之间，变性的蛋白质一般在两相交界处产生一条白色的带。（三）检测 除蛋白前后用紫外分光光度计检测280nm（蛋白质）和260nm（核酸）下的吸收值，多糖浓度为0.4mg/ml对照验证除蛋白的效果。,(四)离子交换纤维素(DEAE-纤维素)进行初步分离 一般选用DE-52型离子交换纤维素（二乙氨基乙基纤维素52）柱的预处理 加蒸馏水浸泡过夜，期间换几次水，每次除去细小颗粒，用0.5mol/LHCl溶液浸泡12h, 蒸馏水漂洗至中性；再用0.5mol/LNaOH溶液浸泡12h, 蒸馏水漂洗至中性。洗脱 样品浓度在20mg/ml左右。先用水洗脱，再用NaCl梯度洗脱，小试时的梯度应密集一些，0.05, 0.1, 0.3, 0.5mol/L洗脱，每瓶8ml, 10min左右一瓶即可。根据紫外检测的结果，再进行梯度的修改。合并流分 硫酸-蒽酮法结合紫外检测,（1）硫酸-蒽酮试剂的配制称取0. 1g蒽酮至容量瓶中，加少量浓硫酸，搅拌使其溶解，加浓硫酸至50ml摇匀，得0.2%的硫酸-蒽酮试剂，尽量现配先用。（2）方法馏分隔管检测，每管取0.5ml，在冰浴中加入2ml硫酸-蒽酮试剂，然后在沸水中煮1015min, 自来水冷却，放至室