CRISPRCas9技术解读ppt课件

1、CRISPR/Cas9系统及其应用程序，introduction and applications of CRISPR-Cas S9 for genome engineering，anliang dong apr.16th，2010， Crispr/Cas-clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Crispr-associated proteins Crispr loci connection Cas genes-CRISPR-associated genes which are translated into pro

2、teins 1.1 CRISPR-Cas系统的研究历史在1987年日本课题组在K12大肠杆菌碱性磷酸酶基因附近发现了连续重复序列，发现它广泛存在于细菌和古细菌的基因组中2002年，官方以集群有规律的间隔命名的短回文重复序列发现了2005年CRISPR的间隔序列(spacer)牙齿宿主菌染色体外的遗传物质和高度动员，据推测，细菌可以通过CRISPR系统以类似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遗传物质的入侵。2007年，Barrangou等人首次发现细菌可以利用CRSPR系统抵抗噬菌体入侵。2008年，Marraffini等发现细菌CRISPR系统可以阻止外源质粒的转移，首次通过实验验证了CRISP

3、R系统的功能。2013年初，MIT研究小组利用CRISPR/Cas9系统，对人类293T细胞EMX1和PVALB基因、鼠标Nero2A细胞Th基因实现了顶点突变。同年，Mali利用CRISPR/Cas9在人类293T细胞和K652细胞基因的靶区形成双链或单链切口，激活细胞的DNA恢复机制，有效诱导外源基因部位插入。1.2CRISPR-Cas系统的结构，CRISPR-Cas系统的构成主要是由间隔序列S(spacers)间隔组成的CRISPR群集，其长度与不连续重复序列R(repeat)相似，前置序列l (lead Cas蛋白是双链DNA核酸酶它类似于滑石粉酶功能，但不需要形成二聚体。(阿尔伯特爱

4、因斯坦，美国电视电视剧，)，Crispr/cas-clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Crispr-associated(cas)genes and Crispr array a series of repeat sequences(direct repeats)inter spaced by variable sequences 作为候选人。然后在CRISPR基因座的5段中合成重复序列。最后，新的间隔序列集成在两个重复序列之间。当再次侵入1.3 CRISPR-CAS系统的作用机制、CRIPSR基因座的表达(包括转

5、录和转录后成熟处理)牙齿细菌时，CRISPR簇首先转换为长crRNA前驱体，然后逐渐加工为小而成熟的crRNA。发挥CRISPR/Cas系统活性或外源遗传物质的干扰crRNA结合相关Cas蛋白形成crRNA-Cas蛋白复合体，通过碱基互补配对正确结合目标DNA，然后Cas蛋白折断目标DNA并分解。，1.3 CRISPR-CAS系统的作用机制，2，CRISPR-CAS系统的应用，2.1 CRISPR-Cas9介导的基因组精确剪辑技术基因组剪辑技术是基因操作技术，该技术可以在基因组层面对DNA序列进行改造。牙齿技术的原理是构建在预定的基因组位置切割DNA的人工内切酶。被切割的DNA是在细胞内DNA

6、修复系统修复的过程中发生突变，达到特定部位改造基因组的目的。通过阿尔伯特爱因斯坦、美国电视电视剧(Northern Exposure)的恢复途径，基因组剪辑技术成为研究基因功能的重要手段之一基因敲除、特异性突变的引入和固定基因基因基因组编辑这种技术也可以用于治疗人类遗传性疾病，因此成为现代分子生物学的研究热点，2.1 CRISPRMali等利用来自脓杆菌和热链球菌的CRISPR相关蛋白Cas9，在人工重组的small-guide RNA(sgRNA)的地图下，正确切下老鼠和人类基因组的特定基因片段。通过可编程RNA的DNA改造技术开创了基因组编辑的新方法。例如：在基因敲除实验过程中，1，从基因

7、序列中找到NGG序列，获得附近20多个碱基的序列，将其与tracrRNA序列融合，设计并合成sgRNA。2，将牙齿序列和cas9基因连接到载体，如图所示。3、变形感觉状态，质粒小提取，测序验证。4、细胞培养及细胞转染5，检测敲除效果。6、建立稳定的敲孔细胞系，抑制2.2CRISPR/Cas9介导的转录和激活转录，CRISPR/Cas9型系统中Cas9的切割域突变失去了Cas9蛋白对的切割活性，但不影响与它结合的能力。失去牙齿切割活性的Cas9蛋白被称为Dead as9。Cas9和gRNA在细胞中一起表达，gRNA可以与Cas9蛋白结合。如果Cas9结合在目标基因的读取盒中，就可以阻止RNA聚合

8、酶的扩张。Cas9结合在目标基因的子区域，可以阻止基因转录的开始、2.2crISPR/Cas9介导转录抑制和转录激活。CRISPRCas9系统用于抑制PAM(bp)和至少12bp的gRNA对。利用CR介导的dCas9，可以正确识别目标基因的特征，并将Cas蛋白与转录激活结合使用。真核细胞的转录激活因子可以通过将Cas9与单纯疱疹病毒转录激活因子16结合获得。3，CRISPR-Cas9技术的优点和前景，3.1CRISPR-Cas9技术的优点，以及实际应用程序方面，CRISPRs比TALENs更易于操作。因为每对TALENs需要重新合成，CRISPR用的gRNA只需要替换20万，所以只需合成一个sgRNA，就可以实现对基因的特异性修正，Cas蛋白没有特异性。编码SgRNA的序列不会超过100bp，因此比配置TALENs和ZFNs更容易、更方便。短sgRNA序列也避免了长而高重复的TALENs编码向量引起的并发症。3.2 CRISPR-Cas9系统的应用前景，目前应用CRISPR-Cas9系统的研究主要集中在基因编辑上。Cas9的真正优点是它具有结合主要生物聚合物(，蛋白质)的特殊能力。各种功能性蛋白质可以与Cas9蛋白融合，然后将gRNA的靶向作用结合到ds的随机部位，发挥人们期待的功能。例如：