预处理和菌体的破碎.ppt

1、第二章 预处理和细胞的破碎,2.1 固液分离的分类 2.2 发酵液的组成 2.3 悬浮液的预处理 预处理的目的 预处理方法 2.4 细胞破碎方法 2.5 细胞破碎理论 2.6 细胞破碎技术 2.7 细胞破碎方法的选择及评价,2.1 固液分离的类型,1、过滤: 重力过滤器、压滤器、真空过滤器 2、离心 3、重力沉降 4、气浮分离：在水中通入或设法使水体产生大量微细气泡，附着于杂质颗粒上，密度小于水而浮至水面，从而获得分离的一种澄清方法。固液分离：处理固体颗粒粒度细小，很难用沉淀法分离。液液分离：用于从污水中分离回收石油，有机溶剂的微细油滴、表面活性剂及各种金属离子。,2.3 悬浮液的预处理,凝聚

2、剂:指的是让不稳定的胶体微粒（或者凝结过程中形成的微粒）聚合在一起形成集合体的过程中所投加的药剂的统称。 种类：A、无机盐类，如硫酸铝、明矾、硫酸铁、硫酸亚铁、FeCl3、AlCl3、ZnCl、硫酸镁等；B、无机碱，如Al(OH)3、Fe(OH)3、Ca(OH)2、CaO等；C、聚合无机盐，如聚合铝、聚合铁。 机理：A、破坏双电层，B、水解后胶体吸附，C、氢键结合等。 絮凝：在絮凝剂高分子聚合电解质的作用下，胶体颗粒和聚合电解质交连成网，形成10 mm大小的絮凝团过程。絮凝剂种类：A、阳离子类，如聚丙烯酰胺(+)、聚苯烯酸二烷基胺乙酯、聚二烯丙基四胺；B、阴离子类，如聚丙烯酸纳、聚苯乙烯磺酸、

3、聚丙烯酰胺(-)；C、非离子类，如聚丙烯酰胺(0)、环氧化乙烯。 机理：絮凝剂主要起中和电荷、桥架和网络作用,细胞产物,2.4细胞破碎方法,细胞破碎物理法和化学法的比较,物理破碎法缺点： A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性失活； B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难； C、细胞碎片大小不一，难分离。 化学破碎法缺点： A、费用高； B、引起新的污染，尤其是其他化学方法； C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。,2.7 细胞破碎技术,1)、固体剪切法(珠磨法, 最有效的物理破碎法) 操作简介,2.7 细胞破碎技术,计算 破碎遵循一级动力学定律, 即 对上述方程积

4、分得 对于n次连续搅拌研磨操作，则得蛋白质的物料平衡式 ：平均停留时间，V：磨腔的总体积，Q：发酵液的流量。,2.7 细胞破碎技术,影响因素 a) 转盘外缘速度(见下图)： 适合条件：圆盘外缘速度 20 m/s, 一般在 5-15 m/s。 b) 珠粒添量和大小 添量：(见上图，添量体积一般占总体积的80-90%) 粒径：一般在0.2mm(实验室), 0.4 mm(工业)。最终由实验确定,2.7 细胞破碎技术,c) 温度：温度在5-40C范围内对破碎影响较小。但研磨产热，功率 ，温度 。如产物热不稳定，必须控温。 d) 细胞浓度x：最佳x由实验确定。一般产热量随细胞浓度的降低而下降，但单位细胞

5、重量的能耗 。 e) 破碎效率： R：每kg成品细胞(如酵母)释放的蛋白量，Q：物料流量，P：珠磨机消耗的功率。 f) 流量Q：破碎为一级反应。,2.7 细胞破碎技术,计算 服从一级反应定律 式中，R为pro释放量，Rm为pro最大释放量. 影响因素 操作压力p：p, R ;相反, R 。温度 2C /10MPa 。 破碎次数N：N，R 。 温度：比速度k与温度有关，温度25C，k1.5倍。 细胞抗破碎系数a：a酵母=2.9，a大肠杆菌 = 2.1。 细胞种类：影响k值。 细胞浓度： Z：常数，p0：破碎所需的最低压力，：细胞浓度的参数。,2.7 细胞破碎技术,阀门底座：刃缘阀座，平边阀座 优

6、点 A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适.,2.7 细胞破碎技术,4) 超声破碎法(1525kHz),2.7 细胞破碎技术,机理 在超声作用下产生的空穴化作用(cavitation)，空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。 优点：适合于多种细胞的破碎 缺点：A、影响因素多，如振幅、黏度、表面张力、液体体积和流速、探头材料和形状；B、超声产生超氧离子毒害作用；C、有效能量的利用率低；D、产热大，需控温；E、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。,2.7 细胞破碎技术,5) 化学破碎

7、法 酶溶法、酸碱法、有机溶剂胞溶法、表面活性剂法 酶溶法：利用酶分解细胞壁上特出的化学键，使细胞壁破碎。 优点： A、产品释放的选择性； B、提取速度和收效高； C、产品的破坏小； D、对外界环境，如pH和温度等要求低； E、不残留细胞碎片。,2.8 破碎方法的选择,选择的一般原则 A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法 破碎技术杂交研究应注意的问题 A、杂交技术可产生很大优势。 B、破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除，产物的分离纯化 C、在发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的

8、影响 D、菌种的培育，胞内产物 胞外产物,2.8细胞破碎的评价,破碎率定义 N0：原细胞数，N：破碎后残存的正常细胞。N0和N的可通过直接计数和间接计数法得到。 直接计数法 方法：样本稀释 - 染色 - 上样 计数。 计算：同上。 优点：方法简单。 缺点： A、计数时间长，B、只有活细胞才被计数，误差大，C、细胞聚集时，不利计数，D、染色误差。,2.8 细胞破碎的评价,间接计数法 方法：样本离心 - 取上清液 - 测特定蛋白质或酶 - 与理论的最大值比较。 计算： Rm：理论最大值，R：实验测得值。 优点：A、方法客观可靠，尤其对蛋白质和酶，B、有多种选择的指标，胞内位置(如胞膜、胞壁、近胞膜

9、蛋白等)，灵活性大。 缺点：影响因素多，如温度、pH值、剪切力、溶液的稀释等。 解决办法：筛选相对稳定和恒定的指标。,基因工程表达产物,存在的问题 A、包涵体 B、N-端多一个蛋氨酸残基、表达产物未糖基化（大肠杆菌） C、表达产物过度糖基化，目标产物变成抗原（酵母） D、大肠杆菌的内毒素 包涵体的解决方法（一般步骤） A、包涵体的分离 B、包涵体溶解、变性、还原，一般用尿素、盐酸胍、SDS C、蛋白质的复性和重新氧化 D、一般的分离纯化,习题,固液分离的类型:过滤(重力过滤器、压滤器、真空过滤器);离心;重力沉降;气悬浮 凝聚：在凝聚剂(如铝盐、铁盐、石灰和NaCl)作用下, 细胞蛋白质等(准)胶体去稳定，并聚集成1mm大小的凝聚块的过程。 凝聚机理：A、破坏双电层，B、水解后胶体吸附，C、氢键结合等。 絮凝：在絮凝剂高分子聚合电解质的作用下，胶体颗粒和聚合电解质交连成网，形成10 mm大小的絮凝团过程。 气浮分离：在水中通入或设法使水体产生大量微细气泡，附着于杂质颗粒上，密度小于水而浮至水面，从而获得分离的一种澄清方法。