第四讲 微生物与生物转化.ppt

1、4. 微生物与生物转化,概述,生物催化剂：微生物（细胞直接进行催化） 酶的来源，催化非天然有机物发生转 化反应 优点：1、同时参与反应的酶的种类多底物范围广 2、不需要进行酶的分离纯化方便，廉价，高效 3、解决辅酶再生问题 缺点：1、副产物多得率低 2、产物分离纯化困难 用途：有机酸、氨基酸、核苷酸、抗生素、维生素、甾体 激素等手性化合物的工业化生产,4.1 微生物学基础,微生物的特点 微生物（microorganism）： 所有形态微小，单细胞的或个体结构较为简单的多细胞 的、甚或没有细胞结构的低等生物的通称。 微生物类群十分庞杂，包括： 病毒(不具细胞结构)、立克次氏体、细菌、放线菌(单细

2、胞) 酵母、霉菌、单细胞藻类、原生动物等,原核生物：不具核膜，核物质裸露，没有有丝分裂过程 真核生物：细胞核有核膜，进行有丝分裂 特点 1、体积小，面积大比表面积大，代谢强度大 2、种类多10万种以上，各具特性(三废处理、合成产品) 3、分布广营养要求不高，生长繁殖速度快，土壤 4、繁殖快，转化能力强 5、适应性强，容易培养诱导酶、抗逆性强、极端微生物 温度、压力、高盐浓度、酸碱、干燥、辐射、毒物等,和化学合成法相比：常温常压、原料廉价、来源广、 不需其他特殊催化剂、环境友好 6、易变异：本质是基因突变，优点，也是缺点可调 常用微生物： 细菌、放线菌、霉菌和酵母菌 1、细菌：球状、杆状、螺旋状

3、，分裂生殖，体积很小 球菌：球形或椭圆形。分裂后产生的新细胞常保持一定 的空间排列方式。（单球菌、葡萄球菌等） 杆菌：杆状或圆柱形。发酵工业中最常用。 螺旋菌：细胞呈弯曲杆状。（弧菌、螺旋菌） 醋杆菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、 大肠杆菌、短杆菌属,2、放线菌 菌落呈放线状而得名（Actinomyces） 厌气菌放线菌属 好气菌链霉菌属，也是放线菌 放线菌多为腐生，少数寄生。 菌落特点：干燥，不透明，表面呈紧密的丝绒 状，上面有一层色彩鲜艳的干粉；菌落和培养基 连接紧密，那以挑取；菌落正反面颜色常常不一致 最突出的特性： 产生大量的、种类繁多的抗生素,目前已发现和分离的5500种

4、以上的抗生素，其中 4400多种为放线菌所产生。 实际应用的有100多种，如链霉素、井冈霉素等。 此外，还可用于： 生产维生素、嵋制剂； 甾体转化、石油脱蜡、烃类发酵、污水处 放线菌的存在范围： 土壤中最多，河流、湖泊和海洋中较少； 大气中也有很多菌丝和孢子，食品、动物上,放线菌为单细胞，革兰氏阳性。 菌丝分为：营养菌丝、气生菌丝和孢子丝 放线菌孢子较耐干燥，不耐高温（65度15分钟） 放线菌的代表属： 链霉菌属 诺卡氏菌属：可用于污水处理等 放线菌属：多为致病菌 小单胞菌属 链孢囊菌属：可形成孢子囊和孢囊孢子 游动放线菌属：孢囊孢子可以运动,3、霉菌（mold） 是一类“丝状真菌”的通称，不

5、是分类学上的名词， 在分类学上分别隶属于藻状菌、子囊菌和半知菌。 定义：凡在营养基质上生长形成绒毛状、蜘蛛网 状或絮状菌丝体的真菌，通称为霉菌。 霉菌的菌落特征和放线菌类似，但是菌落较大， 质地一般比放线菌疏松。 用途：酿酒、制酱、发酵工业、农业、纺织、 食品、皮革加工 但是也会引起发霉变质，是人和动植物致病。,全世界由于霉变而不能食（饲）用的谷物约占2。 目前已知的霉菌毒素达100种以上。其中毒性最强的 是由黄曲霉菌产生的黄曲霉毒素致癌 常用霉菌： a.毛酶： 制作腐乳、豆豉等食品，甾体转化 b.根霉：淀粉酶、糖化酶（米根霉） c.曲霉：制酱、酿酒、制醋、酶制剂、有机酸、糖化 黑曲霉、米曲霉

6、、黄曲霉 d.青霉：产黄青霉、橘青霉、娄地青霉、展青霉 e.红曲、木霉、地霉、假囊霉、脉孢菌、交链孢霉、 赤霉菌、白僵菌（生物农药，昆虫病害的防治）,4、酵母（Yeast） 大多数酵母为单细胞。一般呈卵圆形、圆形、圆柱 形或者柠檬形。 常用的为：酵母属（Saccharomyces）和假丝酵母 （Candida）。主要有酿酒酵母、产阮假丝酵母、 热带假丝酵母、毕赤酵母等。,微生物菌种的分离 1、采样： 地点的确定：筛选目的、微生物分别特征、菌种的特征 一般在土壤中。（有的放矢）取样范围要广 2、增殖培养： 一般需要进行目的菌种的富集 选择有利于目的菌种生长繁殖而非目的菌种不容易生长繁殖 的培养条

7、件。如特殊底物、温度、pH、微量元素、金属离子、 抑制剂等。,4.2 微生物的分离和选育,3、纯种分离 增殖培养后各种菌种的混合物 发酵或者培养要求纯种 方法：a. 划线法 b. 稀释法 目的：获得单菌落 过程中也可以加入筛选控制条件，提高筛选效率 4、性能鉴定 两步法：初筛（快速的培养和测定方法，也可在纯种分离时 进行） 复筛（比较复杂，精确，定量，可以确定目的菌种） 重复实验确认菌种性质，获得几株野生型菌株,诱变育种 野生型菌种性能尚达不到工业生产的要求，因此要进行 “育种：。 方法：基因突变（自然、诱发） 诱变：诱变剂处理（致死率和突变率，正突变和负突变）、 高效筛选方法：可以借鉴野生型

8、的筛选方法 存在主要问题：工作量大、缺乏人工控制、提高幅度有一定 限度（尤其对于高产突变菌种） 工作程序：a.选择出发菌株（连续诱变） b.菌悬液的制备（单细胞或者孢子进行诱变） c.诱变：化学诱变、物理诱变,物理诱变剂：各种射线，最常用的紫外线，太空育种 对DNA发生作用 化学诱变剂：作用原理比较复杂，常用的如亚硝基胍和甲基 磺酸乙酯（EMS） d.变异株的分离和筛选 初筛：菌落形态、色泽的变化（有时会和性质有关联） 指示平板：平板培养基中有指示剂 复筛：营养缺陷型（中间培养淘汰野生型） 缺陷的类型：氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶等 发酵实验，检查其生产性能,重组工程菌的构建 天然微生物中所需要

9、的酶含量少，不能适应生物催化的要求 利用遗传工程技术可以构建新的工程菌 大量表达生物催化所需要的酶 满足工业化生产的需要 操作步骤： a. 载体 b. 基因的分离 c. DNA分子的切割和连接 d. 引入宿主细胞 e. 重组体的筛选 f. 外源基因的表达 （转录、翻译、修饰） 原生质体技术：多酶体系的重组 包括：原生质体诱变、转化或转染、融合等。,克隆天然酶基因,已知序列直接用PCR扩增 未知序列 根据同类酶保守序列设计引物或探针钓基因 建立genomic DNA或cDNA表达文库筛选 纯化酶，测定部分序列，设计引物或探针钓基因,表达系统的共性,基因克隆至表达载体 转化至表达宿主细胞 筛选转化

10、子 生长表达蛋白质,重组酶表达小结,选用强启动子 若需翻译后修饰选用酵母系统 蛋白质折叠和降解是高表达方案中的主要问题 融合表达 蛋白酶缺陷菌株 发酵条件,培养基：微生物的生长、繁殖、产物形成、产品提取分离 工艺的选择 a. 提供构成细胞物质和代谢产物的有关营养物质 b. 提供能量 c. 加入前体物质用于提高产品的产量 包括：碳源（糖类、有机酸、醇和氨基酸、碳氢化合物、 二氧化碳光合作用，化学能） 氮源：有机氮、无机氮、固氮微生物（空气中的氮） 无机元素：酶活、生长因子 生长辅助物质：营养缺陷，酵母粉、麦芽汁 水分：占细胞总量的80-90 气体：氧气和二氧化碳,4.3 微生物培养,培养基优化：

11、单因子实验、正交实验、代谢途径 研究内容：种类、浓度、比例、缓冲能力和种类 粘度、杂质影响、诱导物、前体、促进剂 的加入量、加入时间和加入方式， 各种影响因素相互的作用 文献报道、菌种基本要求、同类微生物的要求 细胞生长和产物形成动力学研究,微生物的营养类型： a. 光能自养微生物：光合作用，光为能源，无机物作为氢的 受体还原二氧化碳合成有机化合物 如：藻类、蓝细菌等 b. 光能异养微生物：有机物为氢受体还原二氧化碳合成有机物 c. 化能自养微生物：以无机物氧化所产生的化学能作为能源， 以二氧化碳作为碳源合成有机物 如：硝化细菌、硫细菌等 d. 化能异养微生物：大多数微生物都属于这类。 腐生型

12、和寄生型,微生物的培养方法 表面培养：类似自然培养 固体培养：固体培养基，设备简单，自动化程度低 液体深层培养：可控性好，设备投资大，工业化生产 菌种的扩大培养新鲜的种子，菌种的分离纯化和复壮 一级种子：摇瓶培养，由斜面培养基中接入 二级种子：种子罐，质量检查，是否染菌 多级种子罐：50立的发酵罐一般使用三级发酵 接种菌龄，接种量 发酵：酶、次级代谢产物，纯种培养，产品提取和精制,目的：使菌种的生命得以延续并保持其生物学特性 菌种保藏方法： 基本原理：根据微生物的生理、生化特点，人工的创造条件 使微生物处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休 眠状态。低温、干燥、缺氧 1. 斜面保藏法：4可以保藏3

13、-6个月，到期转接新鲜斜面 容易发生变异、染菌，可覆盖矿物油 2. 穿刺保藏法：用接种针将菌种穿刺接入培养基的1/2处，然 后覆盖无菌液体石蜡（保持水分、隔绝氧气） 从中接出来时要进行复壮,4.3 菌种保藏,3. 干燥保藏法：适用于形成芽孢的细菌、形成孢子的丝状真菌 和放线菌。 原理：将微生物吸附在各种载体上，干燥后保藏。 使用时要进行复壮，常用的为灭菌的沙子和土壤 4. 悬液保藏法：将微生物悬浮于不含养分的溶液中，如蒸馏水 磷酸缓冲液或生理盐水中，然后密封保藏 5. 冷冻干燥保藏法：保藏期长，变异小，便于大量保藏，适用 范围广，是各保藏机构的主要方法 原理：将微生物或者孢子冷冻，然后在减压情

14、况下利用 升华原理除去水分，使细胞的生命活度处于停止 状态，然后进行低温保藏（一般4）。,常用分散剂：脱脂牛奶和血清 菌种：处于生长后期的微生物，一般细菌培养24小时， 酵母培养72小时，放线菌和丝状菌种培养7天 加入分散剂并刮下微生物菌体或孢子，制成悬液 30左右冷冻，真空干燥，使水分升华 干燥完毕后，抽真空并熔封。 复壮后使用 6. 液氮保藏法：效果好，方法简单，保藏对象最为广泛 浓的悬液加入灭菌后的分散剂中，加入最终浓度10 的甘油或者5的DMSO作为防冻保护剂，立即熔封。 缓慢冷却到25 左右，保藏在196 的液氮罐中。 使用时取出放入3840 的温水振荡融化，然后接种,7. 低温保藏

15、法 20 的低温中用15甘油保藏。 菌种保藏中心 ATCC（美国标准菌种收藏中心） ARC（美国农业部农业研究服务部） NCTC（英国国立标准菌种收藏所） CBS（荷兰霉菌中心保藏所） IFO（日本大阪发酵研究所） 中国有7个菌种保藏中心,4.5 微生物生物转化,定义：利用微生物中特定的酶将人工合成的非天然 化合物进行生物转化，转化液经分离纯化可 得到所需产品的过程。 本质上与直接发酵法是一样的，为酶催化反应 不同：发酵法：多酶低密度转化 生物转化：单酶或者多酶的高密度转化 生物转化优点：工艺简单、产物浓度高、转化率及 生产效率高，副产物少,微生物种类多，含酶丰富，可进行多种生物转化反 应 微

16、生物生物转化反应具有高度选择性，尤其是立体 选择性，可完成一般化学反应难以实现的反应 如甾体、萜类与生物碱等有机化合物中非活泼氢的羟化反应 反应条件温和，适用于不稳定化合物的制备 一般用游离细胞或者固定化细胞培养法,游离细胞转化法： 1、底物的预处理 考虑底物的各种性质，包括渗透性，溶解度，稳定性和毒 性等。 目的：保证底物和催化反应的酶能够相互接触 a.酶的位置：胞内，底物首先要和细胞充分接触 b.底物要透过细胞壁和细胞膜进入胞内 真菌细胞壁透过性较好，因此转化效率高 细菌细胞壁透过性较差，因此转化效率低 一般底物在转化体系中溶解度大，生物转化率就高,常用底物添加方法： 微生物转化反应一般在

17、水溶液中进行，因此水溶性 强的底物可以高效进行反应，对于水溶性差的底物 (大多数生物转化的底物水溶性都比较差，非天然有机化合物) 可以采用下列方法： a.无毒性的溶剂溶解底物，如乙醇、丙酮等。 b.直接添加固体底物，然后添加无毒性的表面活性 剂如吐温系列物，剧烈搅拌，形成乳化液，以减少传 质阻力。,如果底物对微生物有毒，则会干扰微生物的生长， 可以采用下列方法： a. 少量多次添加，控制底物浓度在毒性浓度之下 b. 分步法：首先培养细胞，然后诱导酶的产生，最 后进行生物转化 c. 酸性或者碱性底物以盐的形式添加 d. 挥发性底物在密闭体系中反应 e. 光敏底物在黑暗条件下反应,2、生长细胞培养

18、转化法 在微生物细胞培养前或者培养一段时间后，将底物 直接加入到培养基中，微生物在生长繁殖的同时对底 物进行生物转化。 优点：容易，效率高 缺点：产品分离纯化困难 尤其适用于能以底物作为唯一碳源的微生物,3、静态细胞培养转化法 将微生物细胞发酵培养一定时间后，离心收集菌 体，然后将菌体悬浮于含有底物的水或缓冲液中进 行生物转化。(可以有效控制转化条件) 优点：产物后处理简单，没有培养基成分的污染 缺点：增加了额外的细胞收集和重悬步骤 广泛用于有机化合物的转化，真菌类使用多于细菌 静态细胞转化法所涉及到的酶一般为组成酶，而不 是诱导酶。 转化可以在新鲜培养基中进行，也可以在缓冲液中 进行（可添加0.2的酵母抽提物）。,固定化细胞转化法 固定化细胞 细胞的生长和生物催化过程是分离的 优点：可以长期保持稳定性和催化活性，反覆使用 缺点：生物转化活性比游离细胞低，传质阻力 固定化化细胞较容易，真菌一般固定化孢子 常用固定