PEG诱导细胞融合.ppt

1、聚乙二醇诱导细胞融合，王，细胞融合，在自发条件下或人工诱导下，两个或多个相同基因型或不同基因型的细胞融合成一个细胞的过程称为细胞融合，也称为细胞杂交。同源细胞可以自发融合，这是人体重要的生命活动，如有性生殖过程中配子的融合。异种细胞的融合必须用诱导剂诱导融合。细胞融合技术是指不同种类的细胞通过体外诱导和培养，进行膜融合、细胞质融合和细胞核融合，形成同时具有两种细胞遗传和生物学特性的杂交细胞。常用的人工诱导方法包括病毒诱导、电刺激和聚乙二醇诱导。自发细胞融合早在19世纪，人们就发现在自然条件下生物世界中存在自发细胞融合。穆勒在1838年观察到肿瘤中的多核细胞。从那以后，在被感染的组织中一个接一个

2、地发现了多核细胞，如天花脓疱、水痘损伤的皮肤和麻疹患者的扁桃体。这些多核细胞可能是病毒作用的结果，但当时没有人意识到这一点。1875年，兰格首次观察到脊椎动物和青蛙的血细胞融合，然后一些研究人员也在无脊椎动物中发现了融合细胞。2.由2引起的革命。聚乙二醇作为一种融合促进剂，由于病毒制备困难、操作复杂以及灭活病毒在病毒诱导的细胞融合中的效力差异较大，科学家们试图找到比病毒更简单、更快速、更有效、比病毒更容易制备和控制、活性稳定、使用方便的化学聚乙二醇。加拿大华裔科学家高等人(1974)的研究取得了重大突破。他发现高分子量聚乙二醇(PEG)能促进Ca2存在下植物原生质体的融合，并显著提高融合率，从

3、而迅速推动原生质体技术的基础研究和应用研究。到目前为止，原生质体的应用和操纵它们的方法的发展已经在实验生物学中引起了一场“无声的革命”。同时，庞特考尔沃(1975)发现聚乙二醇可以诱导哺乳动物细胞融合并产生杂交细胞。戴维森和其他人在1976年进一步证实了这一点。未来的研究表明，聚乙二醇不仅能促进植物、动物和微生物的细胞融合，还能促进动物细胞和植物原生质体的融合，促进微生物原生质体和动物细胞的融合，使植物原生质体能够吸收微生物。1975年，阿赫科诺报道了用聚乙二醇成功地将母鸡的红细胞与酵母原生质体融合。1976年，杜德斯和其他人报道了人类细胞可以与胡萝卜原生质融合。戴维(1972)和瓦西尔(19

4、77)用植物原生质体吸收细菌细胞。1975年，淋巴细胞杂交瘤技术建立在动物体细胞杂交技术的基础上。像体细胞融合一样，仙台病毒在杂交瘤早期工作中使用的由解链启动子灭活的方法已经逐渐被化学解链启动子聚乙二醇所取代。戴维森等人于1976年建立了用聚乙二醇诱导哺乳动物细胞融合的方法，该方法也适用于淋巴细胞和肿瘤细胞的融合。由于淋巴细胞杂交瘤技术可以制备出纯度高、特异性强的抗体，适用于大量制备未纯化的抗原，因此在短短几年内已被广泛用于制备各种单克隆抗体。聚乙二醇诱导细胞融合，聚乙二醇的作用机理，聚乙二醇是乙二醇的一种高分子化合物，并且有一系列不同分子量的聚合物。聚乙二醇是一种特殊的脱水剂，它能通过氢键与

5、水结合，导致细胞脱水和质膜结构的改变，从而使细胞相互接触的膜脂双层中的磷脂分子被排空，进而重新排列其结构。此外，膜脂双层之间的相互亲和力和它们之间的表面张力的作用导致相邻的重新排列的质膜在修复过程中彼此融合，这使得细胞的细胞质彼此连通，导致彼此接触的细胞之间的融合。聚乙二醇的最佳条件和细胞的融合效果与聚乙二醇的相对分子质量和体积分数成正比，但聚乙二醇的相对分子质量和体积分数越高，对细胞的毒性越大。当聚乙二醇分子量为4000-6000，体积分数为50%时，细胞破碎少，融合率高。影响细胞融合的其他因素，钙离子可以使带弱负电荷的聚乙二醇与细胞膜表面分子相互作用，引起细胞膜表面电子分布的变化，从而使接

6、触部位的质膜形成局部融合，出现凹陷，形成原生质桥，成为细胞间通道并逐渐扩大，直至两个细胞全部融合。钙离子浓度为50mmol/ml时，融合效果最好。实验结果：观察到两个或两个以上的细胞有质膜融合，但细胞核尚未融合，有些细胞不仅有质膜融合，还有核融合。经过分析和讨论，聚乙二醇分子可以改变各种细胞的生物膜结构，使两个细胞接触点的质膜中的脂质分子撤离并重组，使细胞融合形成融合细胞。本实验用聚乙二醇处理鸡红细胞，制成切片，用显微镜观察。根据实验结果，两个或两个以上的鸡红细胞之间有不同程度的融合，但总体融合率较好。经分析，主要原因如下：由于聚乙二醇与鸡红细胞悬液的接触时间合适，聚乙二醇与鸡红细胞充分接触，

7、因此融合率较高。1.因为在离心过程中红细胞的数量非常少，所以在吮吸时要小心，尽量吸出所有吸附在管壁上的红细胞。此外，抽吸作用不应太大，否则会破坏离心形成的分层。2.聚乙二醇处理时间不宜过长，最多不超过90秒，否则许多细胞会相互融合形成一个巨大的合胞体，否则细胞膜破裂会导致胞质渗漏。3.聚乙二醇处理后，溶液应轻轻清洗，以避免分离新融合的细胞。4.聚乙二醇应在37水浴中加入，这样可以防止聚乙二醇凝固而导致离心失败。5.注意每次离心的时间和速度，否则你不会得到想要的红细胞。新的细胞融合方法和细胞融合技术在生物科学的各个领域都取得了进展，但从事细胞融合研究的科学家从未放弃寻找融合效率更高的方法。虽然用

8、聚乙二醇作为诱导细胞融合的介质具有上述优点，但聚乙二醇诱导细胞融合存在一些固有的问题，如聚乙二醇在有效浓度范围内(50%-55%)对细胞毒性很大，因此人们试图寻找一种新的方法来替代聚乙二醇介导的细胞融合。电脉冲诱导细胞融合技术激光融合技术空间细胞融合技术离子束细胞融合技术不对称细胞融合技术纵观细胞融合技术的发展历史，细胞融合技术的不断完善一方面体现在融合剂上，另一方面体现在新方法和融合对象的不断扩展上。融合剂经历了活病毒和灭活病毒的生物阶段到聚乙二醇化学物质阶段；新方法不断出现，从生物学、化学和物理学到各种方法的综合应用，甚至空间技术的应用。融合对象从动物和植物到微生物，从种内到种间，从近到远。每一次技术更新和改进都会带来应用上的巨大变革和创新，达到为人类服务的目的。从细胞融合技术的发展过程中可以看出细胞融合技术的应用和发展前景，随着细胞融合技术的每一次创新和改进，它都将在各个领域得到快速、充分的应用，进而在实际应用中不断发现新的问题，在解决实际问题的过程中，细胞融合技术将会一个接一个地提升到一个新的水平，使其日趋完善。动物细胞融合、植物细胞融合、微生物细胞融合以及其中的细胞融合已经被不断地应用到基础理论研究和人类生产实践中。如创造新物种、培育新的动物品种、植物育种、种质保存、克隆的快速繁殖、获得优良的