第二章组织培养基本技术.ppt

1、第二章植物组织培养基本技术、第一节实验室设置和基本技术第二节组织培养所需的环境条件和营养成分第三节培养基的制备和灭菌第四节外植体的选择和灭菌第五节外植体的接种和培养第六节外植体的褐变及其预防措施第七节玻璃化现象及其预防措施第八节试管苗的驯化和移植、第一节实验室设置和基本技术、一、 实验室构成二、仪器设备三、培养器和实验用具四、清洗技术五、灭菌技术六、无菌操作、组织培养实验室布局的总体要求是隔离操作方便灭菌容易观察，一、实验室构成、基本实验室、辅助实验室、实验室构成、准备室缓冲细胞生物学实验室温室生化分析实验室、实验台、架子、培养架4.0m、准备室、缓冲室、无菌室、培养室、组织培养准备实验室、缓

2、冲室、培养室、无菌室(1)、无菌室(2)、二、仪器设备、1、基本仪器设备1366911、冰箱、酸订、电炉、天平， 纯水器、培养基分注器、搅拌器、2、灭菌设备蒸汽压力灭菌锅、干热消毒箱、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。蒸汽灭菌锅、干热消毒槽、无菌瓶的过滤装置、喷雾消毒器、(参考图)、(参考图)、3、无菌操作设备、洁净台、无菌接种箱、4、细胞培养设备、摇床、培养架、hzc 1.玻璃器、3、培养器及实验用具、培养皿、三角瓶、培养瓶、2、金属材质用具、镊子清洗技术，1，玻璃器皿清洗，新使用过的塑料容器，2%NaOH浸渍12h，清水清洗，2%5%盐酸浸渍30min，清水清洗，蒸馏水清洗，干预，3，金属

3、用品清洗，热洗涤剂水清洗，清洗(1) 培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法压力9.810410.8104Pa温度121灭菌2030min (2)玻璃容器灭菌：蒸汽高压消毒灭菌干热消毒灭菌，饱和蒸汽压力和相应的温度，(3)塑料容器灭菌：高压蒸汽消毒灭菌多，然后放在酒精火焰上烧灼接种室灭菌、空气消毒灭菌、接种室、洁净台、紫外线灯照射、70u%的酒精清洗、培养材料的接种、紫外线灯照射、(6) 10%的漂白水、饱和漂白剂浸渍30分钟左右、预备、常用消毒剂消毒灭菌比较表、六、 无菌操作，实验者消毒，实验室，无菌台灭菌，实验2 .打开洁净桌和无菌操作室的紫外灯，照射40分钟左右后关闭。 3 .打开过滤室的风扇，

4、将无菌风吹到桌面和周围的桌壁上。 用70u%的酒精擦拭桌子和双手。用含有5，70u %酒精的纱布擦拭装有培养基的培养器，放入桌子。 6 .解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡95%酒精，在火焰上消毒，放置在器械架上。 7 .在酒精灯火焰附近切断备用的接种材料。 8 .打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口来烧瓶口的各部分。 9、取下接种器具，在火焰上消毒。 将培养材料放入培养瓶中，关闭瓶口。 11 .接种结束后，清扫并关闭清洁台。 注意：操作期间必须经常用70u%的酒精擦拭桌子和双手的接种器械浸泡在95%的酒精中，在火焰上消毒。 第二节植物组织培养所需的环境条件和营养成分，一、环境条件、自然条件一样，组织培

5、养中外植体的生长需要如何控制温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养基组成、pH值和渗透压等各种化学条件，以及外植体的部位、大小、细胞密度等温湿度气体渗透压pH值，一般最佳温度在252之间，环境条件，最常用的是光照16h、黑暗8h，一般培养器内的相对湿度达到100%，培养室内环境的相对湿度为70%，氧是愈伤组织生长所必需的。 二、营养成分、植物体内至少含有数十种化学元素，其中大部分在植物体内起一定的生理作用： a、构成各种化合物、参与生物体建设、构成结构物质的b、构成特殊生理活性物质、参与活跃新陈代谢的c、元素彼此协调、离子浓度平衡， 在维持胶体稳定、电荷平衡点等化学方面的作用的d .发

6、育方面，特定的元素会影响植物的形态发生和组织、器官建造。Arnon和Stout(1939 )提出的确定植物必需营养元素的3个标准：亚伦和斯多德，a，由于缺乏该元素，植物生长发生障碍，无法完成其生活史的b .如果缺乏该元素，则表现为特异性病症， 而且这种缺素症可以通过补充这种元素进行预防和恢复c .这种元素在植物营养生理上显示出直接效应，而不是改善土壤的物理、化学、微生物条件的间接效应。 国内外公认的高等植物需要的营养素为16(17 )种： c、h、o、n、p、k、Ca、Mg、s、Fe、b、Mn、Cu、Zn、Mo根据植物体内的含量，可将这些元素分为大量的营养元素：占干物质重量的0.1%以上s等9

7、种微量营养素：占干物质重量的0.1%以下的是0.1mg/kg Fe、b、Mn、Cu、Zn、Mn的p是磷脂的主要成分。 培养基常用KH2po 4、nah2po 4等。 k与碳水化合物的合成、转移、氮代谢等有密切关系。 Mg、s、Ca是叶绿素的组成成分，是激酶的活化剂，对核蛋白质体结构有稳定作用的s是含有s氨基酸的蛋白质的组成成分。 Ca是构成细胞壁的成分，在细胞分裂、稳定质膜结构中起着显着作用，而Ca及降钙素在细胞信号转导中起着重要作用。2、微量元素是微量元素中铁的使用最大的：部分氧化酶的组成成分叶绿素形成的必要条件是使用乙二胺四乙酸铁(EDTA-Fe )螯合物防止铁沉淀，与硼和蛋白质的合成、糖

8、类的运输有密切关系的铜是部分氧化酶的成分， 锰能促进离体根的生长，促进植物的光合作用，呼吸代谢钼参与氮的缺铁症状：叶面变成绿色网状失去了绿色。 随着病情的发展，叶子失绿程度加重，整片叶子变白，叶缘枯萎，引起落叶。 缺铁严重时，新梢顶端枯死。 桃树，缺铜症状：新梢尖端叶尖失绿变黄，叶上出现褐色斑点扩大成深褐色，引起落叶。 枝梢生长不良，其下部芽开始生长，形成群生的小枝。 菊花、缺锰症状：虽然叶脉间有失绿退色，但叶脉仍保持绿色，也有脉间出现坏死斑，缺素症状从幼叶开始。 菜豆，梨缺锰症，缺钼症状：叶小，叶脉间丧失绿色，有坏死斑，叶边烧焦，内侧卷曲。 十字花科植物缺钼时叶子变形，老叶变厚枯焦。 白菜，

9、缺硼症状：受精不良，种子减少，“花不结果”，“花蕾无花”； 根尖、茎尖的生长点停止生长，多会引起形成群生状的各种腐病。 马铃薯、缺锌症状：小叶病、叶变小，两者之间变短。 在叶脉间失去绿色或变白。 植物缺素症、缺氮：首先老叶呈现均匀缺绿现象缺磷：老叶呈蓝色略带紫色，叶缘呈紫红色，叶尖枯死缺钾：首先老叶斑缺绿症状叶缘枯萎，卷曲收缩，茎节间缩短。 钙不足：新叶的叶子变小，枯死，即干燥烧心的硫不足：首先作为新叶的叶子的绿不足或紫发现的缺锰：新叶脉间的失绿； 铁缺乏：叶黄，叶脉绿缺硼：顶和附近的嫩叶变黑坏死，生长矮化，丛枝锌缺乏：老叶脉之间缺乏绿色，出现白色坏死斑的铜缺乏：新叶从叶尖沿叶缘逐渐坏死，严重

10、的整叶枯萎过早脱落的钼缺乏： 3 .碳源碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，糖类物质最为重要。 糖类的特点：热量易利于吸收和利用的浓度一般以2%-5%提供能量，调节渗透压，4、维生素以各种辅酶的形式存在，参与多种代谢活动，对生长分化等有良好的促进作用， 脂溶性维生素和水溶性维生素中常用的维生素是VB1和VB6。肌醇环己醇细胞壁的构筑材料是碳水化合物， 参与磷脂代谢及离子平衡等生理活动促进活性物质的作用6 .氨基酸蛋白质的构成成分有机氮源在细胞可直接吸收利用的培养基中常用的有甘氨酸7，有天然复合体促进愈伤组织和器官生长的化学成分不明，复杂的天然营养混合物，如水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物9

11、 .抑制活性炭吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质外植体的褐变，抑制玻璃苗的产生，促进培养物的生长和分化，促进生根10 .防止抗生素外植体内生菌造成的污染活性炭11 .生长素类促进细胞的伸长和分裂，促进生根，抑制脏器的脱落，控制性别， 延长休眠，尖端优势，单性结实诱导愈伤组织溶解于95%醇或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更为常用的生长素： IAA (吲哚辛) NAA 12 .细胞因子类促进细胞分裂和分化诱导胚状体和不定芽的形成，延缓组织老化用于控制离体造花的0.5-1.0mol/L盐酸或稀薄NaOH常用细胞因子： KT (激动剂) BA(6-总统府基腺嘌呤)2ip 13 .赤霉素

12、类和脱落酸a、赤霉素类的组织培养不太使用的加速细胞的伸长生长促进细胞培养基形态的差异：固体培养基、液体培养基的培养过程的差异：初代培养基、传代培养基的作用的差异：诱导培养基、增殖培养基、定着培养基的营养水平的差异：基本培养基、完全培养基、一、培养基的种类、第3节培养基的制备、灭菌和保存，1，MS培养基的无机盐浓度特别是硝酸盐包含一定量的铵盐无需进一步添加有机附件，二是一些常见培养基的特点，二是White培养基在1943年White为培养番茄根尖而修订的1963年改良，提高MgSO4的浓度，降低硼无机盐浓度，对广泛根培养、胚胎培养有良好效果附表：白色培养基、3、B5培养基是1968年Gambor

13、g等人为培养大豆根细胞而修订的，含有低铵盐的高硝酸盐和盐酸硫胺素、B5培养基的组成和配方，4、N6培养基是1974年朱至清等人为培养水稻等谷类作物的花药而修订的KNO3和药品的准备3、培养基的配方、母液的扩大率及应该调制的培养基体积来修正所需的各种母液及其他附件的量；3、包括培养基的调制，具体操作如下：2.根据修正所需的量依次加入大量的元素、微量元素、铁盐、有机物、生长调整物质母液及其他特殊的附件，均匀6 .封口(拧紧瓶盖)。 由于组织培养必须在无菌环境下进行，因此培养基的灭菌操作非常重要。 培养基分注封口后立即进行灭菌，至少在24h以内完成灭菌程序。 一般采用高压蒸汽灭菌。 四、培养基灭菌、灭菌锅很多。 实验室经常使用便携式高压蒸汽灭菌锅。 使用时，请注意： 1、锅中注入足够量的水，不要引起空烧和干烧2 .放锅时不要过度倾斜，内部有一定的空间，有利于蒸汽流动3 .增压前的高压锅内的空气必须清洁排出。 如果不这样做，容易对灭菌效果产生影响，4、在灭菌中，尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间5 .排