基因的定位克隆.ppt

1、基因的定位克隆，奇怪的突变体，这些突变体是如何产生的？突变体：是在某一性状上具有遗传变异的材料或在某一基因上具有突变的材料。水稻基因定位：它是通过某种方法确定基因在染色体上的实际位置。1.连锁分析，1)概念：基因定位的连锁分析基于这样的原理，即基因在染色体上排列成直线，不同的基因相互连接形成连锁群，即定位基因与同一染色体上的另一个基因或遗传标记之间的连锁用于定位。2)重组分数是基因定位中两个基因之间遗传距离的量度，即基因之间的遗传距离。如果两个基因之间有1%的重组值，它们的遗传图谱之间的距离是1厘。(centimorgan，cM)交换值(RF)(%)=100%重组型配子数/总配子数，重组值越大

2、，两个基因之间的距离越远，基因之间的连锁强度越小；重组值越小，基因之间的距离越近，基因之间的连锁强度越大。3)遗传标记(遗传标记)通过连锁分析，已知的脱氧核糖核酸序列需要作为基因定位的遗传标记。这些标记是孟德尔遗传的，标记位点应该是多态的。4)遗传多态性是指在一个遗传位点上有一个以上的等位基因，并且每个等位基因在群体中的频率高于1%。两点测试杂交和染色体作图，摩根和他的学生斯特蒂文特创造了一种三点测试杂交方法，即三个基因包含在同一个交配中。在这个测试中，一个实验等于三个两点实验。众所周知，黑腹果蝇的三个隐性突变基因，棘层病(ec)、断翅(ct)和横脉缺失(cv)都是X连锁的。眼多刺、断翅的个体

3、与横脉缺失的个体交配，获得三个基因的杂合子(EC、ct、cv的排列并不代表它们在X染色体上的真实序列)。对雌蝇的三个杂合体进行了检测，并与三个隐性体ec ct cv/Y雄蝇进行了杂交，检测出的后代如下表所示。ec ct/cv ec ct cv/Y检验交叉后代数据，结果分析，1。分类，2。确定正确的基因序列。通过双交换型与亲本型的比较，发现改变其位置的基因一定在中心位置，因为双交换的特点是侧基因的相对位置不变，只有中间基因发生变化。因此，可以推断这三个基因的正确序列是ec cv ct。EC CT，CV，EC CT，CV，CT，CV，EC，CT CV，EC CV，CT，CT，EC CV，3。计算重

4、组值。确定图形距离(1)，计算CTCVs的重组值，忽略表中第一列(ec/)的存在，将其放在括号中，比较第二列和第三列：CTCVs之间的重组率=(217 223 53)/5318=0.084=8.4%=8.4厘米，(3)，计算ecct比较第一列和第二列：ECCT之间的重组率=(273 265 217 223)/5318=18.4%=18.4%(2)计算eccv的重组值，忽略表中第二列(ct/)的存在，将其放在括号中，并比较第一列和第三列之间的重组率：4.绘制染色体图时，在计算eccv和cvct的重组值时使用双重交换值，但在计算ecct时不考虑双重交换值，因为它们之间没有双重交换导致的重组。因此，

5、ecct之间的实际双倍交换值应该是重组值加上两倍的双倍交换值。即18.4% 20.1%=18.6%。当三点杂交后代有8个表型时，表明存在双交换，需要用2倍的双交换值进行校正。如果这三个基因彼此接近，通常就没有双重交换类型，后代中只有六种表型，不需要修正。标记1，标记2，目标基因，3。基于图谱的克隆，也称为定位克隆，是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法。其原理是功能基因在基因组中有相对稳定的位点，在分子标记技术准确定位目标基因的基础上，利用与目标基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建基因区域的物理图谱。然后，使用物理图谱通过染色体行走或染色体着陆来接近目标基因(Tanks

6、ley等人，1995)，最终找到含有目标基因的克隆。最后，通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。地图克隆的特点是不需要事先知道基因的DNA序列或其表达产物的信息，但应具备以下两个基本条件。首先，存在根据目标基因的存在与否而建立的遗传分离群体，即定位群体，如F2、DH、BC、RI等。二是开展以下工作：(1)首先，寻找与靶基因紧密连锁的分子标记；(2)利用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体上的特定位置；(3)构建含有大插入片段的基因组文库；(BAC或YAC)；(4)筛选以与靶基因相连的分子标记为探针的基因组文库；(5)利用获得阳性克隆构建目标基因区域的重叠群；(6)通过染色体

7、行走、着陆或跳跃获得带有目的基因的大片段克隆；(7)通过亚克隆获得带有目的基因的小片段克隆；(8)通过遗传转化和功能互补验证，最终确定目标基因的碱基序列、M1、M2，构建遗传图谱，构建物理图谱，染色体行走：基因组行走，筛选基因组文库，序列分析和功能鉴定，对于基因组尚未测序的物种，可以通过染色体行走，但是，这是费时费力的。对于水稻、拟南芥等基因组测序工作已经完成的物种，不使用染色体行走法对其进行定位，直接从构建遗传图谱到构建物理图谱来确定目标基因的候选基因，然后通过互补实验进行验证。分子标记是基于个体间遗传物质中核苷酸序列变异的遗传标记，是基因水平上遗传多态性的直接反映。目前，DNA分子标记技术

8、有几十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴定、基因库构建、基因克隆等领域。分子标记的类型：1 .基于分子杂交的分子标记技术：限制性片段长度多态性(RFLP)；2.基于聚合酶链反应的分子标记技术：随机扩增多态基因，RAPD)简单序列重复3。基于限制性酶切和聚合酶链反应技术的基因标记：扩增片段长度多态性。基于基因芯片技术的分子标记技术：单核苷酸多态性(SNP)，SSR是微卫星DNA，是由多个基序(大多为1-5个碱基)串联重复组成的一种DNA序列。其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，如(CA)n、(AT)n。不同遗传材料重复次数的可变性导致了SSR长度的高度可变性，这

9、是SSR标记的基础。虽然微卫星DNA分布在整个基因组的不同位置，但两端的序列大多是保守的单拷贝序列，因此可以根据两端的序列设计一对特异性引物，通过聚合酶链反应技术扩增它们之间的核心微卫星DNA序列，通过电泳分析技术获得其长度多态性，即SSR标记。初步基因定位，对目标基因进行定位是利用分子标记技术将目标基因定位在目标性状分离群体中染色体的某一区域。近等基因系或整体分离分析通常用于初始作图。近等基因系是指具有不同目标性状基因和相同其他性状基因的两个群体，可通过连续回交获得。由于近等基因系需要连续回交，需要较长的时间，Michelmore等人(1991)提出了群体分离分析法(BSA法)，将分离群体中

10、研究的目标性状按其类型(如抗病性和疾病易感性)分为两组，并在每组中混合一定量的植物DNA形成两个库，这两个库只在目标性状(如抗病性)上有所不同。利用分子标记技术发现两个库之间扩增带的差异，这种多态性可能与目标基因有关。然后，使用所有分离的子代植物来验证多态性是否与目标基因相连，并确定连锁距离。六、精细定位，在初步定位的基础上，设计和筛选更接近亲本且表现出双亲间多态性的引物，然后利用F2群体中的突变体检测筛选出的双亲间多态性引物，逐步缩小范围，将目标基因定位在染色体上一个较小的物理区间内。实例如下：利用SSR标记定位水稻drawf1基因，基本实验方法，F2定位群体构建，植物总DNA提取，聚合酶链

11、反应，聚丙烯酰胺凝胶电泳引物设计，F2群体构建，引物设计通用软件和网站，设计软件：引物3.0 /cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi引物5.0(搜索限制性位点，设计引物)网络引物/cgi-bin/web-primer序列分析软件：脱氧核糖核酸定位(分析序列特征，引物质量，编辑序列)，初步基因定位(牛血清白蛋白法)，筛选亲本间多态性引物，筛选库间多态性引物， 小群体验证，初步定位条带分析，RM1(亲本间多态性，池间无多态性)，RM2(亲本间和池间多态性)。 结论：如果在亲本和库

12、之间具有多态性的引物有可能与目的基因连锁，那么它们可以被小群体验证(重组交换值应小于50%)，那么目的基因可以位于连锁标记的染色体上。我们最初定位的结果准确吗？接下来，我们将使用一些突变体来验证我们选择的标记是否真的与目标基因相连。遗传距离为(单交换和双交换2)/(突变体总数2) 100。我们如何判断目标基因和这些标记之间的位置关系和距离？A P-5 10 18，A P-6 11 12 16，RM2，RM3，交换率越高，标记离靶基因越远，而它离靶基因越近，也就是说，在相应的交换植物中标记越多，离靶基因越远，交换植物越少，它们离靶基因越近。、rm1、rm2、drawf1、rm3、rm4、3.8厘

13、米、2.4厘米、2.0厘米、chr.6、标记、距离。(cm)，目标基因区域的分子标记连锁图，精细筛选双亲间具有多态性的分子标记，用筛选出的多态性标记引物检测定位群体，最终将目标基因锁定在较小的物理区间。七.候选基因的确定，方法(1)查阅相关数据，比较和分析基因同源基因在定位区间的功能，它们是否在其他物种中引起相同或相似的表型，并寻找最可能的候选基因；(2)分析mRNA水平，看其在正常植物和突变体中的表达是否发生了变化，如长度变化和表达变化；(3)进行序列测定，比较正常植物和突变体中基因的核酸序列和氨基酸序列是否发生了变化；(4)进行互补实验，验证候选基因是否为目的基因。逆转录聚合酶链反应(1)提取正常植物和突变体的总核糖