平面色谱法-hjt.ppt

1、平面色谱法,色谱分析法系列课件,药学院药物化学教研室 韩景田 博士 教授,第五章 平面色谱法,第一节 概 述 1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色谱法”一书，推动了这一技术的发展。 因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。 70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪器化，并实现了计算机化。,Thin-layer chromatography of standard PL samples Fig.1,Description: The thermo-st

2、ability of phospholipids and lysophospholipids was determined by one dimensional thin-layer chromatography (TLC). A chloroform-methanol-28% aqueous ammonia solvent system (65:35:8, v/v) provided clear separation of major phospholipids (PL) and their lyso forms. The 5% (w/v) dodecamolybdophosphoric a

3、cid solution in ethanol was used as spray reagent. The thermo stability of phospholipids was evaluated by compare the spots density and area of PL samples with varying heat treatment.,Rapid determination of thermo-stability of phospholipids by TLC,第五章 平面色谱法,定义：平面色谱法(plane chromatography)是在平面上进行分离的一种

4、色谱方法。,一、平面色谱法的分类和原理 分类 纸色谱法：滤纸为载体，纤维素的羟基与水结合形成液-液分配色谱固定相，展开剂由于毛细作用沿滤纸向上运动。-分配色谱 薄层色谱法：将吸附材料均匀固定在载板上，由于吸附剂颗粒间的毛细作用，展开剂（流动相）上行。 -吸附色谱 薄层电泳法：荷电组分样品负载于惰性支持介质（纸、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等），在电场作用下进行分离。,二、平面色谱法的基本流程,确定样品的预处理方法 选择吸附剂和展开剂 制备层析用薄板 点样 层析分离 显色 定性或定量分析 分析结果，给出结论,三、平面色谱法参数,（一）定性参数 1. 比移值Rf (retardation factor;

5、 Rf) 溶质移动的距离与流动相移动距离之比,Rf范围： 0 Rf 1 Rf = 0.20.8（常用） Rf = 0.30.5（最佳）,L,ds1,ds2,图181,2. 相对比移值Ris,讨论 参考物与被测组分在完全相同条件下展开 可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性； 参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 相对比移值Ris与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围可以大于或小于1,（二）面效参数,1、理论塔板数 N=16(ds/W)2 ds:原点到斑点中心的距离 W：组分斑点的纵向宽度,2、塔板高度 H=ds/N=(Rf L)/N ds：原点到展开剂前沿的距离 N越大，H越小。,

6、与展开剂的速率常数、组分在展开剂中的扩散系数、吸附剂的平均粒径及其粒度分布等因素有关。,（三）容量因子k与比移值Rf的关系,容量因子： k=ts/tm ts 、 tm 分别为组分在固定相和展开剂中的保留时间 保留值的定义：,（四）分离参数,1、分离度(resolution; R) 两相邻斑点中心的距离与两斑点平均宽度的比值 R=2(ds2-ds1)/(W1+W2) =2d/(W1+W2),ds1 、ds2 :分别为原点至两半斑点中心的距离， W1、W2斑点的宽度。,2.分离数(separation number; SN),定义：相邻斑点分离度为1.177时，在Rf=0(原点)到Rf=1(溶剂前

7、沿)之间能容纳的色谱斑点数。 W(1/2)0, W(1/2)1为实验测得的某组分色谱峰的半峰宽对ds作图外推至在原点处和溶剂前沿处的半峰宽。 一般薄层板的分离数为 710，高效薄层板可达1020。SN是衡量分离容量的重要参数。,第二节 薄层色谱法,一、主要类型 二、吸附剂与展开剂 三、操作方法 四、定性与定量分析 五、高效薄层色谱法 六、薄层扫描法 七、应用实例,Thin Layer chromatography TLC,概述,1TLC定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上， 形成薄层而进行色谱分离和分析的方法 2操作过程： 铺板 活化 点样 展开 定位(定性)/洗脱(定量),3分离机制：吸

8、附* 、分配*、离子交换、空间排阻 4特点；分离能力强、灵敏度高、展开时间较短、显色 方便。 5应用：药物杂质检查、纯度测定、定性及定量等。,一、主要类型,（一）吸附薄层色谱 固定相为吸附剂的薄层色谱。利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离.经过吸附、解吸、再吸附、再解吸最后混合物得到分离.K大，Rf值小，移动慢；K小，Rf大，移动快。,（二）分配薄层色谱 固定相为液体，吸留在载体上的薄层色谱。利用被分离组分在固定相与流动相中的分配系数不同而被分离。常用的是反相薄层色谱法，固定相是烷基化学键合相，展开剂是水及与水相溶的有机溶剂。,二、吸附剂与展开剂,(一）吸附剂 1. 硅胶：硅胶H-不含

9、黏合剂 硅胶G-含煅石膏（13-15%） 硅胶F254- 既含煅石膏，又含荧光指示剂 2. 氧化铝：可分为中性（pH7.5)、碱性（pH9.0）和酸性（pH4.0）,（二）展开剂 常用的有： 石油醚环己烷二硫化碳四氯化碳三氯乙烷苯甲苯二氯甲烷乙醚氯仿乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇吡啶酸水,吸附剂与展开剂的选择,展开剂的选择：根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性,吸附剂的选择：根据被测物极性和吸附剂的吸附能力 被测物极性强弱极性吸附剂 被测物极性弱强极性吸附剂,图183,三、操作方法,定性分析窄条 定量分析1020cm,（一）薄层板的制备,（二）点样：用毛细管或微量注射器，几微升，24mm （三）

10、展开：见续页 （四）显色方法：日光、紫外光(254、365nm)显色剂等,连续展开：层析缸，预饱和，防止边缘效应浸入展开剂深度0.51.0cm，展开至整板3/4距离,标记。,1 , 2样品 3 标准品,展开方式,展开方式,二维展开在两个垂直的方向上进行展开。将样品点在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂，再将薄层板以与原展开方向成90 的方向进行展开。,四、定性和定量分析,定性分析 利用保留值 测定Rf值 测定相对Rf值，即Ris值。 利用二维色谱（改变色谱条件，比较Rf值是否一致）,定量分析 1. 目视比较半定量 2. 测量斑点面积 3. 洗脱法 4. 薄层扫描法,五、高效薄层色谱法,

11、高效薄层色谱法（high performance thin layer chromatography；HPTLC) 所用的吸附剂颗粒很小 （5m或10m），用喷雾法制成高效薄层板。常用的有硅胶、氧化铝、纤维素和化学键合相预制薄层板。,六、薄层扫描法,薄层扫描法是用一定强度光束照射薄层上的斑点，用仪器测量照射前后光束强度的变化，从而求得物质含量的方法。 检测方法 紫外-可见吸收测定法和荧光测定法 测量方法 投射法和反射法 扫描方式 单波长和双波长 影响薄层扫描定量的因素 均匀度 展开距离 随行标准及点样次序 显色均匀度及稳定性,第四节 纸色谱法,以纸做载体的色谱法，分离原理属于液-液分配色谱法，

12、操作与薄层法类似。 选纸 点样 展开 显色(定性)/洗脱(定量),固定相：纸纤维吸附的水 流动相：与水不互溶的有机溶剂（水饱和正丁醇） 分离机制：同液-液分配色谱 定性参数：,讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分易保留，Rf 小（流动相极性， Rf ） 非极性组分易流出，Rf大（流动相极性，Rf ）,本章小结,掌握: 平面色谱法的基本分离原理及相关参数的计算（比移值、相对比移值，分离度）；薄层色谱法的特点；吸附薄层色谱中吸附剂和展开剂的选择原则。 熟悉: 薄层色谱法的主要操作步骤。 了解: 薄层扫描法的应用及技术；纸色谱法的分离原理及实验条件。,参考书及文献,1.分析化学（第四版

13、）下册，孙毓庆主编，人民卫生出版社 2周同惠等纸色谱和薄层色谱。分析化学丛书第三卷第五册北京：科学出版社，1989 3林珍安等译高效薄层色谱上海：上海科技出版社，1984 4. 孙毓庆主编薄层扫描法及其在药物分析中的应用北京，人民卫生出版社，1990 5. Fried Band Sherma JThin-layer ChromatographyNew York：Marcel Dekker lnc，1982 6. Grinberg NModern Thin-layer ChromatographyNew York：Marcel Dekker lnc，1990。 7. Sherma J and Fried BHandbook of Thin-Layer Chromatography. New York：Marcel Dekker lnc，1991.,（二）相平衡参数,相平衡参数：分配系数K和容量因子k