RNA的转录合成.ppt

1、1,第8章 RNA的转录合成 Section 8 RNA Transcription,原核生物RNA的转录 真核生物RNA的转录 RNA转录的抑制作用,2,原核生物RNA的转录 RNA Transcription in Prokaryotes,转录的基本原则 Basic Principles of Transcription 大肠杆菌RNA聚合酶 Escherichia Coli RNA Polymerase 大肠杆菌70启动子 The E.coli 70 promoter 转录的起始, 延伸与终止 Transcription, initiation, elongation and termi

2、nation,3,转录:以DNA为模板,在依赖于DNA的RNA聚合酶催化之下的一系列RNA酶促合成过程叫做转录,包括RNA链的起始、延伸、终止等步骤。,转录的基本原则 Basic Principles of Transcription,4,5,大肠杆菌RNA聚合酶 E.coli RNA Polymerase,6,1 亚基: 核心RNA聚合酶有2个亚基,由rpoA基因编码. 功能： 1）参与RNA核心酶的组装,尚未发现有明确的转录功能。 2）参与全酶和启动子的牢固结合。 3）当RNA聚合酶核心酶沿着模板移动进行RNA链的延伸时,保证DNA双螺旋的不断地在前面解开,在后面恢复双螺旋。,7,2 亚基

3、: 是RNA聚合酶的催化中心, 由rpoB 基因编码.可能含有两个结构域, 分别负责转录的起始和延伸.具体是 ：结合核苷酸 底物并催化磷酸二酯键形成 证据:(1)抗生素利福平:与亚基结合,阻止RNA聚合酶 转录的开始; (2)利迪链菌素也与亚基结合,抑制转录延伸.,8,3 亚基:是RNA聚合酶的催化中心，由rpoC 基因编码, 负责核心酶与模板DNA的结合。,9,4 因子: 大肠杆菌中最常见的因子是70. 特性: （1）与核心酶结合形成了全酶,在启动子识别中 起关键性的作用； （2）原核生物含有多种因子，以能识别各种类型的启动子； （3）RNA链延伸至8-9nt时， 因子就离开核心酶； （4）

4、 因子数量只有核心酶的30%，因此在任何时刻只有1/3的聚 合酶是全酶。,10,5 亚基： 亚基的功能尚不清楚,也有人认为亚基对于RNA聚合酶的结构和功能没有太大的影响。,11,大肠杆菌70 启动子 The E.coli 70 promoter,1. 70在基因中的位置及序列,为了方便,人们将mRNA开始转录的一个碱基(转录起始点)定为+1,沿转录方向顺流而下均用正值表示;溯流而上的启动子部分,均用负值表示。,12,2. 70的特征 大小40-60bp; -10序列, 也叫pribnow框,含有保守序列 TATAAT, 其中带底线的称为保守T,它存在于目前已知的几乎所有启动子中,一般位于6(5

5、)到9(8).该序列是聚合酶启动DNA解旋的序列.,13,2. 70的特征(续上) -35序列, 也叫Sextama框,也是RNA聚合酶覆盖的部分。 RNA聚合酶依靠其亚基识别该位点,因此又称为RNA聚合酶识别位点。其保守序列为TTGACA。,14,2. 70的特征(续上) 启动子区域的共同功能: (1) -35序列组成增强与聚合酶因子相识别和相互作用的识别区； (2) -10序列直接影响DNA的解旋速度；,TTGACA.16-18bp.TATAAT5-8bp.CG/AT -35sequence -10sequence +1,15,启动子效率 -10序列和-35序列之间距离的改变影响启动子的活

6、性。间隔17bp活性最强（16-18，15-20bp） 弱启动子没有-35序列。如：lac启动子，lac基因的表达需要一个辅助激活因子受体蛋白CAP(cyclic AMP receptor proteizod) 与靠近启动子上的CRP位点结合，以增强启动子与RNA聚合酶的结合从而进行转录起始。,16,转录的起始、延伸与终止 Transcription, Initiation , Elongation and Termination,1 启动子结合 Promoter binding 2 DNA解旋 DNA unwinding 3 RNA链起始 RNA chain initiation 4 RNA

7、链延伸 RNA chain elongation 5 RNA链终止 RNA CHAIN TERMINATION 6 依赖的转录终止 Rho-dependent termination,17,1.Promoter binding,2. DNA Unwinding and initiation,3. Elongation,DNA解旋区(转录泡),18,17bp,3. Elongation,19,Termination (1)不依赖因子的转录终止(Rho-indepent termination),发夹结构特点:回文序列中富含G.C碱基对,在回文序列的下游方向又常有6个8个AT碱基对；,20,21,

8、(2) 依赖因子的转录终止 (Rho-depent termination),结合RNA上72个核甘酸,发夹结构特点:依赖因子的终止子中回文序列的G-C对含量较少。在回文序列下游方向的序列没有固定特征,其A-T对含量比前一种终止子低。,22,因子是RNA聚合酶的一种重要的蛋白质辅助因子。催化解开DNA-DNA和RNA-DNA双螺旋结构。,23,真核生物RNA的转录 Transcription in Eukaryotes,真核生物的RNA聚合酶 Eukaryotic RNA Polymerases 真核生物的启动子 Eukaryotic Promoter,24,真核生物RNA聚合酶 Eukary

9、otic RNA Polymerases,真核细胞中有三种RNA聚合酶： RNA聚合酶I、RNA聚合酶、RNA聚合酶。除了这3种聚合酶以外,真核生物细胞中的线粒体和叶绿体还含有其他的RNA聚合酶,25,3种RNA聚合酶的性质和功能,26,RNA聚合酶亚基 RNA polymerase subunits,三种聚合酶均含有12个以上的亚基,其中编码每一个RNA聚合酶两个大亚基的DNA序列具有同源. 三种聚合酶均含有与E. coli RNA Pol 核心 (2)亚基相同 源的亚基. 其中最大亚基与E. coli RNA Pol 中的亚基相似,第二大亚基与E. coli RNA Pol 的含有活性位点

10、的亚基相似. RNA Pol I 和III,共存两个亚基,Pol II 专有亚基与E. coli RNA Pol 的亚基具有同源性. 至少还有5种小亚基普遍存在于这3种聚合酶中,此外仅存在于某一特定聚合酶中的亚基还有4-7个.,27,真核生物RNA聚合酶的活性 Eukaryotic RNA polymerase activity,真核生物的RNA聚合酶与原核生物的共同点： （1）转录方向为53,合成与反义模板链互补的RNA （2）转录起始时不需要引物,只需要前体核苷酸ATP, GTP, CTP,UTP,28,真核生物的RNA聚合酶与原核生物的不同点： （1）有三个聚合酶。 （2）真核生物RNA

11、聚合酶在与启动子结合、起始转录之前需要一些额外的起始蛋白（转录因子）的参与。 （3） RNA 聚合酶II的羧基端含有一段7个氨基酸的重复序列，称作羧基末端结构域，即CTD (carboxyl terminal domain )；这7个氨基酸的重复序列是Tyr（酪）-Ser（丝）-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser。在老鼠中重复52次，在酵母中重复26次。这种结构对酶的活性是必要的。,29,真核生物的转录因子,（1）基本转录因子（basal factor） （2）上游因子（upstream factor） （3）诱导因子（inducible factor）,30,真核生物的启动子 Eukar

12、yotic Promoter,启动子：启动子是指位于基因5 端上游，能够被RNA 聚合酶和其他转录因子识别并与之结合，从而起始基因转录的一段DNA 序列，是基因表达调控中非常重要的顺式作用元件。 调控元件：顺式作用元件(启动子，增强子，沉默子），反式作用因子 启动子类型：I型启动子、II型启动子、III型启动子,31,rRNA 基因(rDNA) 人类rDNA编码产生一个45S的rRNA转录物 (13000nt)，这一转录物随后被切成18S (2000nt), 5.8S (160nt) 和 28S (5000 nt)各1个的 rRNA. 人类细胞在不同的染色体上分布有5簇rDNA重复基因（串联基

13、因簇），每簇有40个拷贝，拷贝之间被非转录的间隔序列分开（图） 这种RNA多基因拷贝的连续转录是产生足够且加工的rRNA。rRNA和蛋白质结合形成了核糖体,(1) I型启动子（ RNA聚合酶I启动子）,32,processed into,rDNA,33,每一个rRNA簇被称为一个核组织区域（nucleolar organizer regions）. 在rRNA合成活跃阶段，前rRNA转录物与rDNA捆扎在一起可在显微镜下看到“圣诞树” （Christmas tree structures）样的结构.（图）,34,2. I 型启动子的特征 I型启动子由两部分的转录控制区域构成:核心元件(Core

14、 element，CE) 和上游控制元件(Upstream control element, UCE),前 rDNA,RNA Pol I promoters in human cells,35,上游结合因子(Upstream binding factor1, UBF1)：一种特异DNA结合蛋白, 与UCE和核心元件上游的一段序列结合,UBF1可使转录速率大大增强. UBF1的两个结合位点序列之间没有明显的相似性, UBF1的分子先结合一个序列元件,随后通过蛋白-蛋白之间的互作结合,导致在两个位点间的DNA形成一个环状结构.,3. RNA聚合酶与转录因子,36,选择因子1(Selectivity

15、 factor1, SL1)：聚合酶I 转录所必需. SL1结合并稳定UBF-DNA复合物,且与核心元件游离的下游部分相互作用. SL1本身没有与启动子特异结合的特性,它促使Pol I与UBF-DNA复合物的结合并起始转录.,37,38,(2) II型启动子：RNA聚合酶II识别,RNA Pol II (RNA聚合酶II) 1）RNA Pol II 存在于核质中 2）负责所有编码基因和一些snRNA基因的转录 3）合成的前mRNA需经过一系列的加工,如RNA 5端生成帽子结构、RNA 3端加上poly A 尾巴以及内含子剪接,39,Typical RNA Pol II genes,40,II型

16、启动子 Promoter,特征： （1）TATA box：在上游约-25-35bp位置，有7对共有碱基序列5-TATA（A/T）A（A/T）-3。决定RNA Pol II 的位置或正确的起始转录。 （2）帽子位点（Cap site):即转录的起始位点，大都为A碱基。 （3）CAAT box：即上游调控元件（UREs）。保守序列为GG（C/T）CAATCT，一般位 于-75bp附近。该序列确保启动子的有效转录。,A,41,其他真核生物的启动子： （ 1）缺乏TATA框，只含起始元件，如老鼠的末端脱氧核苷酸转移酶基因，其起始元件位于转录起始点附近，从-6至+11，序列为GCCCTCATTCTGGA

17、GAC。 （2）没有TATA框，也不含起始元件，只有20-50bp的GC区。 这些启动子的转录效率很低。,42,食用菌gpd启动子：,1 ATTCAAGCAGTCAATGGATTGGAGTGTATTTAGAATCGAAGGTTGTGGAA51 CAAGGAAAAGATGCGGACGAAAAACACAACTGATCCTTTTATAGATAATC101 GCGCTTCAGTCAAATCTTGATTGCGTGATGTTGTGACTTCGACAATAGCC151 CTAAAGTCTAGACCTTAGAACACTTTAGTACCTCGGACCTGCGATTGGGT201 AGGATTTACTGGCCGA

18、GTCCTTTGGGATGGACTGCCAATCAGCAAACGTT251 CTTCAGTTCTATCGCCCCATGACTAAGGTTGCCTGGAACCGTGCTCGAGC301 TTTGGATGGAAGTGCCTTTGAAAAGCCCTGCAAAGTCTTGCAAATGCTAC351 AGCTTCCTCCCTGGCCTGGGTTTGTTGTTCTAGAACTACTCTCATTCTTA401 TCTTCTGCATACAACCATTTCATGCTATCCCAGGATACACCGGTTTCACC451 GTAGTAGCCTTATGGATGCAACTTTGACGCACTGACAATCTGACTG

19、ATAT501 CGACCAATAAGAATAGATAAAACTCCCTGTCCGAGTCCTTTCCGTGATAC551 ATGTGGCTCTCCGACTGCACTCTAACGCCGATAGGATACGGGCCCGCTCA601 GATAACCAGCA,43,Gfp基因在灰盖鬼伞菌丝中的表达,ck- pLg-gfp转化子Lg2 pGg-gfp转化子Gg1,普通光源,蓝光激发,ck- pLg-gfp转化子Lg2 pGg-gfp转化子Gg1,荧光显微镜下的菌丝荧光图,44,ck- pLg-gfp转化子Lg2,pGg-gfp转化子Gg1 pLr-gfp转化子 Lr1,共聚焦显微镜下菌丝荧光图片,4

20、5,Fluorescence microscope,46,增强子Enhancer ：在远离转录起始点（上游或下游）的一段可增强启动子活性的调控元件，大小为100-200bp。最初在DNA病毒SV40的基因组中发现。 特性： （1）加强相连基因从正确起始位点的转录活性； （2）增强子无论是在下游或在上游均可激活转录； （3）无论是在下游或在上游，可在远离起始位点1Kb以上发挥作用； （4）两个启动子串联在一起时，增强子优先激活距离最近的那一个。 沉默子Silencer:,47,II型基因转录的转录因子和转录起始复合物,转录因子：真核生物RNA聚合酶转录需要的各种蛋白质辅助因子称之。以TFIIX表

21、示，以发现顺序命名，如：TFIIA、TFIIB等。 转录起始复合物的组装过程：p268-269,48,（3）III型启动子：RNA聚合酶III识别,RNA聚合酶III: 1）Contains at least 16 different subunits 2）Located in nucleoplasm(核质) 3）Synthesizes the precursor of 5S rRNA, the tRNAs and other snRNAs and small cytosolic(胞质) RNAs,III型启动子的类型（下图）： 基因内启动子 转录起点上游启动子,49,Promoters fo

22、r RNA polymerase III,May consist of bipartite(双向的) sequences downstream of the startpoint, with boxA separated from either boxC or boxB. Or they may consist of separated sequences upstream of the startpoint (Oct, PSE, TATA box).,5SrRNA基因,U6等基因,tRNA基因,50,tRNA 的基因内启动子,(1) Transcription control regions

23、 (promoters) of tRNA lies after the start site. (2) Two highly conserved sequences within the tRNA coding region, called A box (5-TGGCNNAGTGG) and B box (5-GGTTCGANNCC). These sequences also encode important sequences in the tRNA itself, the D-loop and TC-loop (tRNA二级结构形式). Highly conserved sequence in tRNAs are also highly con