05-蛋白质的分离、纯化和表征.ppt

1、蛋白质的分 离、纯化和表征,第五章,一、蛋白质的基本性质,1、 蛋白质是两性电解质 蛋白质是两性电解质，可解离基团 主要是侧链R基上的官能团以及肽链N末 端的-NH2和C末端的-COOH 天然状态下，蛋白质的大部分可解 离基团可被滴定,2,一、蛋白质的基本性质,3,一、蛋白质的基本性质,等电点(pI)： 蛋白质所带电荷的性质和数量取决于分子中可解离基团的种类、数目及溶液pH值。净电荷为0时的pH是该蛋白质的等电点,4,等离子点： 当没有中性盐的阴、阳离子干扰时，蛋白质分子中解离的质子数与接受的质子数相等时的pH是蛋白质的等离子点,一、蛋白质的基本性质,2、沉降系数和沉降系数单位 在强大的离心力

2、场作用下，蛋白 质密度大于溶液密度时就会沉降，沉 降速率与蛋白质分子的大小和密度及 分子形状、溶液密度和粘度等有关,5,一、蛋白质的基本性质,沉降系数： 单位离心场的沉降速度，以s表示 沉降系数单位(Svedberg单位)： 将10-13秒作为一个单位，用S表示 人Hb的沉降系数为4.46S 沉降系数常用来近似描述生物分子的大小,6,一、蛋白质的基本性质,7,一些蛋白质的常数,一、蛋白质的基本性质,3、 蛋白质的胶体性质与沉淀性质 分散相质点 100 nm，悬浊液 1-100nm之间，胶体溶液 蛋白质分子大小介于胶体质点范围 蛋白质溶液由水化层和双电层稳定,8,一、蛋白质的基本性质,蛋白质的沉

3、淀方法 1）盐析法(不会使蛋白质变性,可逆) 2）有机溶剂沉淀法(易使蛋白变性) 3）重金属盐沉淀法(易使蛋白变性) 4）生物碱试剂和酸沉淀 单宁酸、苦味酸、KI、磺基水杨酸、HNO3 5）加热法,9,二、蛋白质的分离纯化,(一)、一般原则 1、前处理 动物组织或细胞：匀浆器、超声波 植物组织和细胞：研磨、纤维素酶 细菌细胞：高压挤压、溶菌酶 2、 粗分离：等电点沉淀、盐溶、盐析 3、 细分级分离：层析法和电泳法 4、 结晶,10,(二)、方法,1）溶 解 度（等电点沉淀、盐溶盐析、有机 溶剂分离和温度的影响） 2）分子大小（透析和超过滤、密度梯度离心、 凝胶过滤） 3）电荷性质（电泳和离子交

4、换层析） 4）吸附性质（层析） 5）对配体分子的生物学亲和力,11,依据如下性质选择和建立提纯方法：,2、盐溶和盐析 盐溶（salting in） 加入低浓度中性盐使蛋白质溶解度提高的现象 盐析：加入饱和或半饱和中性盐时，蛋白质溶解度降低并析出的现象,12,pH和离子强度对乳球蛋白溶解度的影响（曲线上的数值为NaCl 浓度）,1、等电点沉淀和pH控制 不同的蛋白质有不同的等电点,调节溶液的pH, 可分离蛋白质混合物,(二)、方法,3、电泳(electrophoresis) 电泳 在外电场作用下带电颗粒向着与其电 性相反的电极移动的现象 电泳迁移率或泳动度（） 单位电场强度下蛋白质分子在溶液中 的移动速度 = /E ：颗粒泳动速度，E：电场强度,13,常见的电泳种类： 区带电泳：在支持物上电泳时，蛋白质混合物 被分离成若干区带 薄膜电泳：使用醋酸纤维素膜和聚酰胺薄膜 凝胶电泳：凝胶有分子筛效应，分离效果好 毛细管电泳（HPCE）：系统分辨力高，进样量 少，可分离手性化合物 等电聚焦电泳： 该法分辨率高，适于分离分子 量相同而电荷不同的两性分子,14,(二)、方法,4、亲和层析 利用蛋白质对配体