实验三 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质

1、实验三：用聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离血清蛋白，掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理，学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用。实验目的：聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续体系(即不连续的缓冲液组成、ph值和凝胶孔径)，通过浓度效应、分子筛效应和电荷效应，可以根据血清中各蛋白质组分的分子大小和电荷进行有效分离。实验原理，由交联单体聚丙烯酰胺(Acr)和亚甲基双丙烯酰胺(Bis)形成的三维网状凝胶。双：交联剂过硫酸铵：引发剂，提供自由基，引发聚合；四甲基乙二胺：催化剂，加速自由基的引发和释放速度；聚丙烯酰胺凝胶聚合(PAG):1。浓缩效应、分离机理：不连续

2、凝胶层孔径：浓缩凝胶孔径大，分离凝胶孔径小，不连续酸碱度：电泳缓冲液酸碱度=浓缩胶酸碱度=6.7；分离凝胶酸碱度=8.9，缓冲离子不连续：甘氨酸-(慢离子)在电泳溶液中；凝胶中的氯离子；Pr-在它们之间，电位梯度是不连续的，有效迁移率=迁移率离解度。在电泳过程中，氯离子运行最快，留下一个低电导率区域，导致高电位梯度(电位与电导率成反比)，这使得甘氨酸离子赶上氯离子，蛋白质被压缩在它们之间。2.当不同分子量或分子大小和形状的蛋白质通过一定孔径的分离凝胶时，它们受到不同程度的阻断，表现出不同的流动性。3、实验仪器和试剂、电泳装置、稳定电源、圆盘电泳槽、毛细管滴管、刻度移液管、球瓶、玻璃管和胶帽、微

3、量移液管、注射器和长针、脱色摇床、TEMED-四甲基乙二胺，避光。过硫酸铵(新制备的)染色溶液：0.1溴酚蓝溶液洗脱液：7乙酸其他试剂：参见下表中储存溶液的制备。Acr和Bis:储存在棕色瓶中，实验步骤：1 .每人取一根电泳管，在胶帽中加入一滴40的蔗糖，塞住电泳管的底部，并塞紧。2.准备分离胶：(12片可装胶)2毫升1号、2号和4毫升水，在球瓶内混合均匀，用真空泵抽至无气泡；加入8毫升3号，搅拌均匀，备用，最后加入，用毛细管滴管将胶倒入电泳管中，离管口2厘米处，然后沿玻璃管壁在离胶面约1厘米处缓慢加入3-5毫米高的水层，垂直放置，直到界面重新出现，表明凝胶已经聚合。3。填充分离胶。配制浓胶：

4、 (可装12片胶)4号1毫升，5号2毫升，6号4毫升，在球瓶中混合均匀，用真空泵抽出至无气泡；加入1毫升3号，搅拌均匀备用，最后加入5。吸取上层分离胶的水分，将浓缩胶倒在高度约1.5厘米的分离胶上，然后沿管壁小心加入高度约0.5厘米的蒸馏水。垂直放置，直到凝胶化。糊化后，吸收上层覆盖的水分；取下玻璃棒塞，吸出较低的蔗糖溶液。将电泳管放入橡胶塞中，放入电泳槽中，然后在下槽中加入缓冲溶液，以排出管底部的空气。样品制备：血清：1-2滴40%蔗糖：1滴0.05%溴酚蓝：1滴，在EP管中混匀备用，将缓冲液倒入上罐中，盖住玻璃管上端，排出管内空气，检查有无泄漏。用微型取样器吸取30微升样品溶液，并将其涂在浓缩胶上。8。样品装载，9。电泳，上部槽的阴极；在下槽阳极，稳定流量：1.5毫安/管，3分钟，2.5毫安/管，约1小时，至玻璃管的3/4。10.剥离凝胶，电泳后取下玻璃管，用长针注射器吸取蒸馏水作为润滑剂，将针头插入玻璃管内壁和凝胶柱表面之间，缓慢旋转玻璃管，使针头前进制胶时，彻底摇匀，最后加入促进剂TEMED。注意观察实验现象：界面、