4细胞培养-正常组织细胞的培养.ppt

1、正常组织细胞的培养,病原学教研室 申艳娜,2,主要内容,培养细胞的取材 组织材料的分离 原代细胞培养 几种细胞培养方法举例 建立细胞系,3,主要内容,培养细胞的取材 组织材料的分离 原代细胞培养 几种细胞培养方法举例 建立细胞系,4,培养细胞的取材,取材的基本要求 新鲜标本 严格无菌操作 尽可能减少对细胞的机械损伤 尽量去除血液、剔除脂肪、结缔组织等 同时保留组织学标本（光镜和电镜）,培养细胞的取材,基本器材和用品 手术器械 青霉素小瓶（含培基或缓冲液） 小烧杯 培养皿,6,培养细胞的取材,皮肤和粘膜的取材 内脏和实体瘤的取材 血细胞取材 骨髓、羊水、胸腹水内细胞的取材 其他组织的取材,培养细

2、胞的取材,皮肤和粘膜的取材 上皮细胞的来源 方法似外科断层皮片手术 面积一般2-3mm2，取材尽量薄 可用高浓度抗生素漂洗,人类角质形成细胞,8,培养细胞的取材,内脏和实体瘤的取材 常用的细胞培养材料 内脏除肠道外多无菌 实体瘤因破溃、感染可能伴有细菌,9,培养细胞的取材,血细胞取材 染色体分析 淋巴细胞体外激活，进行免疫治疗,骨髓、羊水、胸腹水内细胞的取材 无需特别处理，离心后直接接种,10,主要内容,培养细胞的取材 组织材料的分离 原代细胞培养 几种细胞培养方法举例 建立细胞系,组织材料的分离,机械法 化学法,组织材料的分离,细胞悬液的分离 低速离心 500-1000rpm 10 min,

3、13,组织材料的分离,组织块的分离 机械分散法 机械分散法 注射器针芯挤压 不锈钢滤网 剪切分离法,14,组织材料的分离,组织块的分离 机 械 分 散 法,15,组织材料的分离,组织块的分离 消化分离法 胰蛋白酶 适合胚胎、上皮、肝、肾等组织消化。 pH、温度、酶蛋白浓度、组织块大小影响消化效果。 浓度为0.10.5，pH 8.0. 与EDTA混合使用。,16,组织材料的分离,组织块的分离 消化分离法 胶原酶 分为、四种类型。 根据分离组织类型选择相应型的胶原酶。 对胶原有较强的消化作用，适合消化纤维性组织、上皮和癌组织。 浓度为0.030.3。,17,主要内容,培养细胞的取材 组织材料的分离

4、 原代细胞培养 几种细胞培养方法举例 建立细胞系,18,原代细胞培养,原代培养 定义：是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。 优点：生物特性未发生很大变化，最接近和反映体内生长特性。,原代细胞培养,培养方法 组织块法 消化法,20,原代细胞培养,可能遇到的问题 完全无细胞游出或移动； 有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代； 有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡；,21,原代细胞培养,可能遇到的问题 传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。,22,原代细胞培养,问题的解决方法 加入适宜底物 把经过纯化的细胞

5、接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。,23,原代细胞培养,问题的解决方法 加入生长因子 应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。,24,主要内容,培养细胞的取材 组织材料的分离 原代细胞培养 几种细胞培养方法举例 建立细胞系,表皮细胞 在人和动物体内，表皮细胞生长在胶原基质膜上，并从基质膜获取生长分化所需要的物质，因此体外培养培养需要使用某些基质、培养液及包括滋养层在内的一些添加物。,几种细胞培养方法举例,无菌切取皮肤标本，用DBSS冲洗35遍。 将标本的上皮层面朝下放入干燥的

6、培养皿中，加数滴PBS使之湿润，用弯剪尽可能除净皮下脂肪和结缔组织，将标本切成大约1cmX2cm的小块。 用无Ca2+、Mg2+的PBS 冲洗标本至少3次，将标本放入胰蛋白酶溶液中或中性分散酶II中，4放置15-48h，或37 1-3h。,几种细胞培养方法举例,几种细胞培养方法举例,表皮层和真皮层分离时,表皮层为棕色，真皮层为白色，观察到表皮与真皮分离时将其一如到另一10cm塑料平皿，真皮向下，用5ml血清完全培养液冲洗，用弯镊轻轻将表皮剥脱，放入含20ml培养液的50ml离心管中，反复吹打，过100目尼龙筛，使角化上皮细胞分离。,滋养层细胞制备 在已形成单层的3T3细胞培养瓶中加入丝裂霉素，

7、使3T3细胞不在分裂增殖，即可作为表皮细胞的黏附滋养细胞。 黏壁剂包被 用0.01%的胶原蛋白铺于培养瓶的底部，过夜，弃上清，40烘干，制成胶原蛋白黏附膜，紫外线照射2h消毒备用。,几种细胞培养方法举例,29,几种细胞培养方法举例,脐静脉血管内皮细胞 取健康产妇分娩正常新生儿后6小时以内的脐带，立即浸泡在含青霉素、链霉素的D-Hanks液中，洗去外部血污。在超静工作台上剪去有钳子夹痕、扭曲、凝血块、穿孔段后分离出10-15厘米一段。,30,几种细胞培养方法举例,脐静脉血管内皮细胞 用注射器吸取 Hanks液，充分清洗脐静脉，用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉管腔内缓慢注入0.1I型胶原酶8

8、-10ml，静脉充盈后，用另一只血管钳夹住防胶原酶返流。置入37培养箱内消化10分钟。,以15X105个细胞的密度接种在适量DMEM或FAD培养液中，37培养1-3天，细胞贴壁后，冲洗未贴壁细胞。 传代培养：0.05%-0.1%的EDTA孵育10-30min，细胞变圆后，在用0.1%的胰蛋白酶和0.05%EDTA消化，吸管吹打是细胞完全脱壁。,几种细胞培养方法举例,32,几种细胞培养方法举例,脐静脉血管内皮细胞 松开一端血管钳，将含有内皮细胞的消化液收集到离心管中，然后注入含10胎牛血清的RPMI1640培基终止消化并冲洗血管，以便获取更多的内皮细胞。,33,几种细胞培养方法举例,脐静脉血管内

9、皮细胞 将冲洗液一并注入离心管，以1000 rpm离心 l0分钟，弃上清液，加RPMI 1640培养液，接种于50ml一次性塑料培养瓶中，置37培养箱内，在5C02 24小时后换液一次，除去红细胞和未贴壁的细胞继续培养，隔两天换液一次。,34,几种细胞培养方法举例,脐静脉血管内皮细胞,35,几种细胞培养方法举例,脐静脉血管内皮细胞,36,几种细胞培养方法举例,人滑膜细胞 将手术取下的新鲜的滑膜组织置于无菌的平皿中，剔除脂肪组织，用含青、链霉素的D-Hanks洗涤两次，用眼科剪将滑膜组织充分剪碎，吸入螺口管中，1200rpm/min，离心10分钟。,37,几种细胞培养方法举例,人滑膜细胞 离心后

10、，弃上清，加入一倍体积的0.4II型胶原酶，置于37 5CO2培养箱中消化60分钟（每15分钟吹打一次）。初次消化后，离心弃上清，再加入一倍体积的0.25胰蛋白酶继续消化30分钟。最后加入含15血清的RPMI1640培养液终止消化。,38,几种细胞培养方法举例,人滑膜细胞 消化后的细胞悬液经200目的筛网过滤并离心洗涤两次，再用含10小牛血清的RPMI1640培养液重悬细胞，接种于培养瓶中，置于375CO2培养箱中培养24小时，轻轻去除仍悬浮的细胞，继续培养，每3天换液一次,约10天左右可长满瓶底。,39,几种细胞培养方法举例,人滑膜细胞 细胞长满培养瓶后即可进行传代培养，用0.05胰蛋白酶-

11、0.02EDTA消化后按几种细胞培养方法举例,40,几种细胞培养方法举例,人滑膜细胞,41,几种细胞培养方法举例,人滑膜细胞,42,几种细胞培养方法举例,乳鼠心肌细胞 分步消化法,对于股骨中骨髓细胞的分离，则可以采取冲洗股骨腔的方法获得。,几种细胞培养方法举例,实验材料,小鼠 小鼠的抓法： 从鼠笼内将小鼠尾部抓住并提起，放在磁盘上或报纸上。,小鼠的处死：颈椎脱位法 右手（左手）抓住鼠尾用力向后拉，同时左手（右手）拇指与食指用力向下按住小鼠头部，在颅骨基部的后侧与颈椎两侧，施加压力，使头颅和脑一起与脊髓分离。当脊髓与脑分离时，伴有大量的肌肉活动。经研究证明，这种方法能使实验动物对痛觉不再敏感。,

12、股骨骨髓细胞悬液的制备,冲洗骨髓腔 ： 用剪刀剪开股骨的一端，将注射器针头插入股骨开口端。然后用剪刀剪开股骨的另一端，用D-Hanks液多次冲洗骨髓腔，收集细胞悬液于离心管中。,47,主要内容,培养细胞的取材 组织材料的分离 原代细胞培养 几种细胞培养方法举例 建立细胞系,48,建立细胞系,细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。,49,建立细胞系,细胞系 无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核

13、型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。 无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。,50,建立细胞系,细胞株（Cell strain） 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。 由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。,51,建立细胞系,ATCC American Type Culture Collection 美国标准菌库,52,建立细胞系,细胞入库检测项目 组织来源和已传代数：应说明细胞供体所属物种，来自人或动物，个人性别、年龄、取材的器官和组织。肿瘤组织应说明临床和病理诊断及病历号等。 培养条件及方法：说明使用培养基、血清种