2-切片技术.ppt

1、，显微镜(光学显微镜)陆晓东，江苏大学基础医学与医学技术学院组织胚胎学系，分辨率：光学显微镜：0.2米，电子显微镜：0.1毫米，显微长度单位为毫米(毫米)=10-3米微米(米)=10-6米纳米(纳米)=10-9米，显微技术为：光镜、光镜电子显微镜：电子显微镜、电磁透射电子显微镜(TEM):扫描电子显微镜、扫描电子显微镜(SEM):观察组织或细胞表面的三维结构，组织学研究技术，光学显微镜技术显微镜第17、18次，光学显微镜技术显微镜第18/19、19次，目镜、物镜、载物台、光源、音量控制、开关按钮、控制装置、精细聚焦控制、粗聚焦控制、10x4低功率观察、10X10中功率观察、10X40高功率观察

2、、10X100油显微镜、普通生物显微镜放大倍数相差倒置显微镜用于观察培养细胞。一般来说，用光学显微镜很难区分无色透明的活细胞，只有用相差显微镜才能观察到。相差显微镜可以将不同程度的厚细胞和细胞内各种结构引起的光的不同折射转化为光密度差(明暗差)，使显微镜下的结果对比度明显，图像清晰。细胞培养、光学显微镜标本制备等。光学显微镜技术制备普通标本：HE染色、石蜡切片。特点：石蜡切片使石蜡充分浸入组织，组织块变硬，有利于变薄。制备的切片能很好地保存组织的原始结构，具有良好的透明性和长期保存性，有利于在显微镜下观察组织图像。该方法包括以下步骤：(1)取材与固定：福尔马林脱水：酒精透明：二甲苯包埋：石蜡切

3、片：切片机染色：he，取材与材料、位置和方法的确定：根据教学和科研的具体要求：新鲜组织块大小的材料可以快速、均匀地渗透到组织中。例如，在制作病理检查和科研切片时，取0 . 10 . 2厘米以保持组织的原始形状和清洁度，并将其固定。为了防止死后组织细胞的变化，防止自溶和腐败，并保持组织中细胞的原始形状和结构，应将组织块切割并立即放入固定液中。常用的固定方法有：小组织固定；标本固定；固定液为1:420；最常用的方法，但组织块不容易太大和太厚，所以最好把它放在冰箱里，并固定很长时间，特别是对于组织化学实验中使用的材料，冷冻和固定的效果会更好。注射灌注固定：一些组织块过大或固定液很难渗透到内部，或整个

4、器官或动物体需要固定。应采用注射固定或灌注固定。将固定液注入血管，通过血管的分支到达整个组织和全身，从而达到完全固定的目的。固定液：纯固定液(10%甲醛固定液和95%乙醇)混合固定液：酒精-甲醛固定液(9份95%酒精和1份40%甲醛)；曾肯溶液(重铬酸钾2.5g，氯化汞5.0g，蒸馏水100ml，冰醋酸5ml)；布恩溶液(25毫升苦味酸饱和水溶液，25毫升40%甲醛，5毫升冰醋酸)脱水和透明标本固定和清洗后，组织含有更多的水，因此组织块中的水必须更换。这个过程叫做脱水。脱水步骤为：80%、90%、95%、100%不同浓度的乙醇2小时，该过程可通过脱水机的自动控制来完成。丙酮也是一种脱水能力很强

5、的脱水剂，但由于其脱水能力很强，对组织有严重的收缩作用，所以一般不用于科研和实验乙醇、丙酮等。不溶于石蜡，但也会经历一个溶剂置换过程，该过程可以溶解在石蜡中，这称为透明。常用的透明剂有二甲苯、氯仿、冬青油等。脱水脱水是透明的，浸泡在蜡中的透明组织被移入融化的石蜡中，这样蜡就完全浸入组织中。这个过程被称为蜡浸泡和蜡渗透。浸泡蜡时应注意以下几点：石蜡分为软石蜡和硬石蜡。熔点为4254，通常称为软蜡，熔点为5662，称为硬蜡。浸泡蜡时，应先用软蜡处理，再用硬蜡处理(普通浸泡蜡的熔点分别为5254、5456和5658)，这样组织中的透明剂才能完全去除。浸蜡温度：浸蜡温度应高于熔点25。如果温度太高，组

6、织会过度收缩或变脆。如果蜡浸泡在培养箱中，温度应控制在6065以内。浸蜡时间：可根据组织块大小和组织类型确定。30分钟，持续几个小时，包埋：将浸泡在蜡中的组织放入融化的石蜡中，石蜡凝固后，将组织包裹在其中，这一过程称为蜡块，这一过程称为包埋。包埋用石蜡和加热的镊子不应过热，以免烫伤组织并破坏组织结构。石蜡包埋的温度应等于组织块本身的温度。如果温度不同，组织和周围的石蜡就会破裂。用于包埋的石蜡应不含杂质，并具有一定的粘度和韧性。蜡的熔点与组织块和硬组织(如骨组织、肌肉组织、皮肤等)相容。)可嵌入硬度更高的石蜡。包埋用石蜡可以重复使用，包埋、包埋、切片机、冷冻切片机、刀、切片机臂、组织块、切片、切

7、片、切片机载玻片，切片机是如何工作的？切片，在切片机上(蜡)，在冷冻器上(冷冻)，安装，冷冻切片是一种在低温下将组织快速冷却到一定硬度，然后切片的方法：在低温恒冷箱中冷冻切片法，使用材料，使用不固定组织的材料，不要太大太厚。取出组织支架，将组织平放，在其周围滴入包埋剂，迅速将其放在冷冻台上，并将其冷冻。对于小组织，首先取一个支持物，滴下包埋剂并让其冷冻，然后放入小组织并滴下包埋剂。将冷冻组织块夹在切片机支架上，启动粗略前进和后退键，转动旋钮使组织变平。根据不同的组织，调整要切割的厚度。原则上，它是一个有密集细胞的薄切口，和一个有细纤维和许多细胞的稍厚切口，一般在510微米之间。调整防侧倾板。制

8、作冰冻切片的关键在于防卷板的调整，这就要求操作者小心准确地将其调整到合适的位置。切片时，切片可以在第一时间顺利通过刀的防卷板之间的通道，平放在刀架的铁板上。此时，可以提起防侧倾板，并取下和连接载玻片。应根据不同的组织选择不同的冷冻度。冰箱中的冷冻程度主要取决于不同的组织，不能一概而论。例如，当切割未固定的脑组织、肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不应该太低，大约为-10-15。当切割甲状腺、脾脏、肾脏、肌肉等组织时，可将其调整到-1520左右。当用脂肪切割组织时，应该将其调整到-25左右。当切大量脂肪时，应该调整到-30。冷冻切片、冷冻切片、染色切片并固定30秒1分钟。用水清洗。苏木精染色35分

9、钟。差异化。蓝色在碱性水中20秒钟。曙红染色1020秒。脱水，透明，用中性树胶密封。涂片，研磨，HE染色，苏木精碱性染料染色蓝色被苏木精称为嗜碱性，如细胞核，核糖体，伊红伊红酸性染料如粗面内质网被伊红染色，这是所谓的嗜酸性，如细胞质，膜状结构(线粒体，溶酶体，光滑内质网)，中性或与这两种染料亲和力差，1。取样2、固定3、漂洗4、脱水5、透明6、蜡渗透7、包埋8、修整9、切片10、染色。石蜡切片HE染色操作步骤常规石蜡切片HE染色程序(1)脱蜡至水1二甲苯5-15分钟2二甲苯5-15分钟3无水乙醇3分钟495酒精3分钟580酒精3分钟670酒精3分钟7自来水洗涤(2) 染色1哈里斯苏木精溶液5-

10、7分钟2自来水洗涤5分钟31盐酸溶液分化30秒4自来水洗涤5分钟51氨水返蓝10秒6自来水洗涤15-20分钟795酒精3分钟81曙红酒精溶液1-2分钟，(3)脱水，透明度和密封l95酒精2分钟，无水酒精2分钟，无水酒精2分钟， 二甲苯5分钟，染色，手动，自动，HE染色和预防措施任何石蜡切片在染色前必须用二甲苯脱蜡，石蜡切片需要平干燥，以便组织可以牢固地粘附在载玻片上。 组织切片脱蜡的质量与二甲苯的温度和时间有关。二甲苯使用时间过长，应及时更换。在he染色过程中，成败的关键在于鉴别。如果由于不适当的区分而没有去除应该区分和脱色的部分，或者由于不充分的区分而导致染色不均匀，反染色对不能得到对比色。

11、此外，流水洗涤时间的长短也与组织是否变蓝有一定的关系。值得一提的是，染色的成败不仅在于染色工艺，还在于过度老化的组织材料或长时间固定在甲醛中的组织，过度酸化会影响染色；或者不适当的组织固定和固定不充分的组织自溶会模糊染色。曙红染色后，必须用梯度酒精，特别是无水酒精脱水，脱水必须彻底，否则会影响透明度。脱水后，用二甲苯透明后即可密封。透明度应该注意有足够的时间来取得好的结果。密封时，中性胶不应添加过多或过少。将密封好的切片平放在摊盘上，及时放入恒温箱中，在40-50烘烤15小时左右，有利于切片的保存。组织化学是将化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物学的原理和技术与组织学技术相结合而产生的技术。

12、它可以定性和定位地显示组织切片中某种物质的存在和分布。它还可以用微型分光光度计或图像分析仪在光学显微镜切片中进一步测量物质的反应强度，以获得定量信息。将这项技术应用于游离细胞样本(如细胞涂片)被称为细胞化学，这是一种普通的组织学。一般组织学的基本原理是在切片中加入某种试剂，并与组织中待检测的物质发生化学反应。最终产物或者是用于光学显微镜观察的有色沉淀物，或者是用于电子显微镜观察的重金属沉淀物。周期酸希夫反应(PAS反应)通常用于糖：中，以显示多糖和糖蛋白的糖链。糖被强氧化剂高碘酸盐氧化后，高碘酸盐与无色品红硫酸络合物(即希夫试剂)结合形成紫红色反应产物。PAS反应正周期酸希夫反应，是一种测定组

13、织或细胞中是否存在多糖的方法。氧化希夫试剂多糖醛沉淀紫红色，脂质：标本用甲醛固定，冷冻切片，用油红O、尼罗蓝或苏丹红脂溶性染料染色，使脂质(脂肪和脂质)显示相应的颜色。锇酸也可以被固定和染色，脂质显示黑色。通过核酸3360展示DNA的传统方法是Feulgen反应。切片先被稀释。然后用希夫试剂处理形成紫红色反应物。如果同时显示脱氧核糖核酸和核糖核酸，则使用甲基绿荧光素进行反应。甲基绿和细胞核DNA的结合是蓝绿色的，而核仁和细胞质中的高嘌呤和核糖核酸的结合是红色的。酶3360通过显示其催化活性来显示酶的存在。程序是在含有特定底物的溶液中培养切片，底物在酶的作用下形成初级反应产物。它与某种捕获剂结合

14、，形成显微镜下可见的沉淀物，即最终反应物。例如，为了显示酸性磷酸酶，首先将切片放入含有酶底物(常用的-甘油磷酸钠)的溶液(pH 5.0)，底物被酶水解释放磷酸；硝酸铅与磷酸反应生成精细的磷酸铅。嗜银性：硝酸银直接还原显色。嗜银性：加入还原剂后才能显色。异染性：用碱性染料如甲苯胺蓝染色后，它不呈蓝色，而是紫红色(肥大细胞)。免疫细胞(组织)化学抗原(银)和抗体(抗体)特异性结合。一些特殊标本需要进一步处理，以提高检测的灵敏度和特异性，减少非特异性干扰。1.蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，从而促进抗体和抗原的最大结合。常见的蛋白酶包括胰蛋白酶、胃蛋白酶和链霉蛋白酶。2.在非特异

15、性吸附的免疫组织化学技术中，非抗原抗体反应的阳性染色变为非特异性染色。防止非特异性染色的一个有效方法是使用相同的动物血清(非免疫血清)作为第二抗体来吸附和阻断底物，然后进行抗原抗体结合反应。如有必要，也可以用约2%的牛或人白蛋白来阻断切片，以减少非特异性染色。在免疫组织化学染色中，标记物的选择很少，因此在光学显微镜或电子显微镜下很容易识别出体内不存在物理或化学性质稳定、能与抗原或抗体结合的相同或相似的物质，并且其结合物也是稳定的。目前，常用的标记物包括荧光色素、放射性同位素、重金属、微粒、酶等。应该建立一个对照实验。为了确定结果的可靠性，必须在实验中设置一个控制。一般来说，建立一级抗体的质控品，包括阳性质控品、阴性质控品、替代质控品、空白质控品、自我质控品和吸收试验。(1)阳性对照与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应显示阳性结果，即为阳性对照。(2)如果测试结果为阴性，则阴性对照为阴性对照。阴性对照还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等。排除假阳性结果。免疫组化结果应严格判断。阳性细胞的染色分布有三