液相色谱故障诊断.ppt

1、I. 常见问题 基线噪音,可能的原因：,流动池脏,检测器灯有问题,如果是周期性的，电压或泵的脉冲,温度对检测器的影响,气泡经过检测器,基线漂移, 梯度洗脱 温度不稳定 (示差检测器） 流动相中有污染物 柱中的流动相没有平衡 体系中有污染物流出,可能的原因：,鬼 峰,鬼峰即使不进样也会出现的峰,没有进样,3,7,15,17,问题1- 流动相脏 问题2- 容器污染 问题3- 柱子污染,20% - 100% MeOH,没有进样,峰 型,双 峰,柱 塌 陷,柱中有死体积,过滤片部分堵塞,只有一个双峰组分的共洗脱,可能原因：,样品与溶剂不匹配，溶剂与柱子不匹配,峰 型,所有的峰都展宽,柱效降低柱死体积,

2、大进样量 / 质量,高粘度流动相,部分峰展宽,前次进样后流出的组分,大分子量样品蛋白或聚合物,样品与流动相不匹配,峰 型,原因：,部分峰拖尾,二次保留效应残留硅醇基的反应,小峰紧跟在大峰的后面流出,柱头有污染,金属,所有峰拖尾,额外的柱效应,柱坏/不适当的溶剂,不适当的样品量,峰 型,峰 型,原因: 流动相吸收本底高 进样过程中进了空气 离子对分离中的系统峰 样品组分的吸收(RI或UV)低于流动相,宽 峰,柱外体积增加,* 在进样口到柱或柱到检测器之间，使用细的短的连接管 * 保证所有的管路接头都使用正确 * 用小体积检测池 * 减少进样量或降低样品浓度,HPLC常见问题,系统压力问题 压力高

3、 压力低或没有压力 压力不稳 流路基线噪音问题 基线不稳定(不重复) 长、短程振荡 基线漂移 噪音脉冲尖刺,HPLC常见问题分析,系统压力问题 压力高的原因 温度太低 流速太高 流动相粘度大 管路堵塞 仪器或色谱柱堵塞 压力传感器问题,HPLC常见问题分析(续),系统压力问题 压力低或没有压力 温度太高;流速太低 泵关闭或保险丝断了 泵未输送流动相 储液瓶中无溶剂 低压限设置不当泵未正确排气 溶剂入口过滤头堵 入口管路中有空气泵失效 系统内有渗漏处 所用溶剂不正确 自动进样器在Purge时卡住,HPLC常见问题分析(续),系统压力问题 压力不稳 压力传感器问题 泵排气不充分 泵失效 流动相未正

4、确脱气 所用溶剂不混溶或易挥发,HPLC常见问题分析(续),流路基线噪音问题 短程振荡 泵压不稳 泵入口管松,弯或堵塞 溶剂混合不充分 检测池中有大气泡 泵入口阀脏或失效 泵柱塞杆密封垫磨损 检测器出口溶液成滴状流入废液瓶,判断故障与故障排除的原则,规则一确认问题至少发生两次以上。如果问题不重复 出现，很难证实其确实存在。 规则二一次只变化一个因素，以使你能够确认所变因 素与问题之间的关联。 规则三恢复原状。如果使用更换组件方法来查找问题 之所在,完毕后应将原有完好组件安装回原处。 否则,换下的组件将来很难再利用,会造成浪费。 规则四尝试预测将来可能发生的问题。利用成功的故 障排除经验来改善您

5、目前的预防保养工作,使现 有问题再发率降至最低。 规则五养成记录的好习惯。一个好记录是成功地进行 故障排除的关键。,色谱图常见问题,色谱图常见问题主要有两类: 色谱峰峰形异常问题 例如负峰,宽峰,肩峰,双峰,峰形不对称等 色谱峰保留时间问题 保留时间不稳定等,色谱图常见问题分析(一),色谱峰峰形异常问题: 色谱图中未出峰: 进样问题:未进样或样品分解 流动相问题:泵未输液或流动相不正确 检测器设置不正确,或检测器有问题 一个或几个峰是负峰 流动相吸收本底高 进样过程中进了空气 离子对分离中的系统峰 样品组分的吸收(RI或UV)低于流动相,色谱图常见问题分析(一)(续),色谱峰峰形异常问题: 峰

6、比预想的要小 样品粘度过大 进样器有问题或进样体积有误 检测器设置不正确,定量环(Loop)体积不正确 检测器输出未置零 用了不正确的检测器输出信号 检测池被污染 检测器的灯可能有问题,色谱图常见问题分析(一)(续),色谱峰峰形异常问题: 双峰或肩峰 进样量或样品浓度过大 保护柱或色谱柱进口堵塞 保护柱或色谱柱污染或失效 前伸峰 进样量或样品浓度过大 溶样的溶剂相对于流动相太强 保护柱或色谱柱污染或失效,色谱图常见问题分析(一)(续),色谱峰峰形异常问题: 拖尾峰 保护柱或色谱柱问题:污染或失效(选择合适的柱子) 进样问题 检测器时间常数不正确 平头峰 检测器设置不正确 进样体积太大或样品浓度

7、太高,色谱峰保留时间问题: 保留时间飘忽不定(各次运行之间) 系统不稳定或未达化学平衡 泵压力不稳(泵头里有气泡) 进样体积过大或样品浓度过大 温度波动 流动相混合不均匀 色谱柱被污染,色谱图常见问题分析(二),色谱峰保留时间问题: 保留时间增加或减少(各次运行之间) 系统不稳定或化学平衡不足 泵流速变化 温度变化 色谱柱污染,柱效下降 流动相被污染 溶剂入口过滤器堵或管路堵塞 系统渗漏,色谱图常见问题分析(二)(续),色谱图常见问题分析(二)(续),色谱峰保留时间问题: 保留时间改变到一个新的恒定值 流动相不正确或其组成不正确 泵流速变化 实际输液的流速不正确(泵失灵或故障) 环境温度变化；

8、柱温不正确 色谱柱尺寸或类型不正确 色谱柱被污染 流动相含有稳定剂或稳定剂发生变化 输液系统的梯度滞后体积不正确,液相色谱实用技术 色谱柱的使用和保养,色谱柱的选择,非极性或极性较小的样品可用一般的C18柱 酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的C18柱，PH范围2-9（12） 糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，GPC有专用柱,键合相色谱柱,以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上作为固定相。这种固定相要占所有柱填料的60-70% 优点 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响 缺点 pH值不能小于2或大于8 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相

9、同,反相HPLC柱（C18）的性能,常规C18填料的稳定性 硅胶基质填料 pH范围：2-8 pH值大于7时键合相粉碎或溶解 pH值小于2时键合相的化学键断裂 经常用缓冲液 固定相降解 填料新的键合技术 - PH范围 2-12 - 稳定性好，使用寿命长,良好的色谱实验习惯,拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件 定期检测柱效,色谱柱的使用及操作,流动相的转换 特别是GPC柱 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱样品及溶剂的要求,色谱柱的保养（一）,样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度 如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防

10、止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用,样品准备,为什么溶剂和样品要过滤?,溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。 色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 样品过滤头的类型： 30mm 内径：适用于大进样量的过滤，由0.2m 和0.45m 两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50l。 13mm 内径：适用于范围广的过滤，由0.2m 和0.45m

11、两种规格,材料为纤维素。 3mm 内径：适用于小进样量的过滤，由0.2m 和0.45m 两种规格。处理样品体积为7l。,色谱柱的保养（二）,流动相方面 除去微粒 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白检验） 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂 流动相对样品的溶解度 有机溶剂或水的比例,溶剂过滤-除去微粒,不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器以及色谱柱。 遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器和色谱柱的寿命： 使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。 用滤膜过滤

12、溶剂去除微生物。 每两天更换或过滤溶剂。 避免溶剂瓶直接日照。 向溶剂中加入0.0001-0.001M的叠氮化钠。,溶剂准备：过滤,选择合适的滤膜,聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜：适用于水基溶剂，不适用于有机溶剂，推荐用于蛋白质和其相关的样品。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸、70%乙醇、二氯甲烷、不适用于DMF二甲基甲酰胺 再生纤维素滤膜：具有蛋白质吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。 注意：1）每张滤膜只能用一次。 2）水相和有机相不要搞混。,溶剂的相溶性,溶剂信息,避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂： 卤化物碱金属溶液

13、和相应的酸溶液。 高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸。 能够形成卤素自由基或酸的氯化试剂及其混合物。 含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂。 在有机溶剂中的有机酸溶液。 含有强络合剂的溶液。 四氯化碳和异丙醇或THF混合液。,溶剂截止波长,溶剂准备：脱气,流动相使用前为什么要脱气？,流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。,常用的脱气方法比较

14、：,氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染 抽真空脱气法：易抽走有机相。 超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。 在线真空脱气法：LC 真空脱机利用膜渗透技术， 在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。,典型的流速,流动相的保存,有机溶剂流动相: 室温下密封,避光保存 缓冲盐流动相: 当日现配现用 低温下密封保存,一般不超过3天 防止长菌 有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相: 低温密封保存 防止有机相的挥发

15、选用适宜的容器,分,保存于聚乙烯瓶中的超纯水,测试条件 水样: 40ml trace enrichment 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水 100% 乙腈 波长: 254 nm,保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水,测试条件 水样: 40ml trace enrichment 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水 100% 乙腈 波长: 254 nm,色谱柱日常使用,过滤所有的溶剂和样品 使用保护柱 不要把柱接头上得太紧，损坏接头螺纹易渗液 开机时，流速和柱压要逐渐增加 进样前检查色

16、谱系统的各个接头是否有漏液 注意色谱柱的pH值使用范围 不要高温下过长时间使用硅胶键合相柱子 关机前先用水冲洗整个系统，移走缓冲液后再用有机相冲洗 不要高压冲洗柱子,色谱柱保护,在线的保护装置,给色谱柱提供物理的保护 除去样品及流动相中的颗粒 给色谱柱提供化学的保护 防止分析柱被化学污染 装置 在线过滤器 自装填料保护柱 预装保护柱,新型的保护柱,特点 高质量, 高效填料 - 不损失柱效 增加分析柱效 - 增加适应范围 20mm柱长 - 脏样品载荷能力大，能延长保护柱寿命 手可拧紧接头，安装时不需要工具 通用柱套 - 适用于所有的HPLC柱(3.9及4.6内径) 整体式- 使用方便，容易 各种

17、不同填料配合色谱柱,色谱柱常见毛病,柱压过高 多少才算高? 不同色谱柱有差异 不同系统有差异 不同溶剂有差异 柱效低 重复性差 不出峰，回收率低,柱压过高,为什么柱压会过高 微粒堵塞 样品 流动相 密封垫 柱床膨胀 不可逆吸附 细菌生长,柱效低,为什么柱效低 色谱柱被污染 过滤片部分堵塞 样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞 色谱柱内的死体积 流动相pH值及组成不合适造成固定相流失 流速急剧变化造成固定相物理损坏 机械震动造成固定相产生裂缝 柱床收缩或干枯,重复性差、回收率低,实验的重复性差 色谱柱被污染 流动相pH值及组成不合适造成键合相流失 样品溶剂不同或样品本身不稳定 回收率低，不出

18、峰 “不可逆”吸附 固定相过强或流动相过弱 非特异性吸附,色谱柱的日常清洗,对所做的样品要有充分的了解 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗（如反相C18柱用100%甲醇或乙腈） 硅胶柱的一般方法 先用甲醇洗去极性杂质，再用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化 键合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗 柱子尺寸 柱子体积 冲洗体积 150 x4.6mm 2.5ml 50ml 200 x4.6mm 3.3ml 65ml 250 x4.6mm 4.2ml 80ml *再有杂质严格清洗： 20倍柱体积的水-相同体积的0.05mol/L硫酸，最后用流 动相清洗,色谱柱的清洗-物理阻塞,在安装柱前后测试压力差 如果柱压力太高，反装色谱柱，并用10-20倍柱体积的 流动相冲洗色谱柱，监测压力变化 若出现沉淀 (如：蛋白凝聚、细胞物、聚合物) 设法用相应的可溶性溶剂，如 0.1% TFA/ 80% 乙腈, 6M 盐酸胍, THF, HFIP 若仍无效，应考虑更换过滤片,色谱柱头塌陷的修补,柱头有塌陷可用填料修补： 1）松开柱入口接头，拆下不锈钢烧结过滤器，常见柱头塌陷，剔掉无规则床层和带色填料，使柱床呈白色水平面，滴一滴甲醇，加少许填料使沉降，如此反复多次后，用刮刀将填料