免疫荧光与免疫组化技术.ppt

1、病 理 技 术 学,病理技术学,一门伴随研究疾病发生和发展、演进与形态、代谢功能改变规律而诞生的方法学。 任务：研究如何创立和运用经典的及现代的生命科学技术和方法，探讨疾病的病因、机制与病理变化，为认识疾病的本质和疾病的病理诊断提供技术支撑，是对病理技术的继承、发展和创新。,病理技术学的内容,大体病理解剖和大体标本的固定制作技术 细胞和组织标本制备的基础知识、原理和技术 电子显微镜的基础知识、原理和技术 免疫组织化学和核酸分子杂交等原位分子检测的理论和技术 分子生物学与病理学交叉应用的有关分子病理的理论和技术 生物芯片技术 细胞凋亡和细胞增生活性的理论和技术 器官移植的组织配型和染色体样本的制

2、备理论和技术,病理技术学的内容,细胞通讯与细胞信号传导的分子机制和技术 原子力显微镜理论和技术 应用动物实验、细胞培养单克隆抗体技术和转基因及基因剔除技术 计算机图像分析，激光共聚焦显微镜以及远程病理技术 显微切割技术 临床细胞学诊断技术及应用 信息病理学和数字切片技术 诊断机器人 关于病理技术的规范化、标准化、质量控制和实验室认证、管理等,一、组织病理学技术与细胞病理学技术,1、组织病理学技术： 是病理学最重要、最基础、应用最广泛的技术，是病理学最重要的组成部分之一，是以研究组织或细胞形态改变为主的各种技术原理、实验操作、结果判定、适用范围和优缺点的学科。 主要包括常规石蜡制片技术、快速冰冻

3、切片技术和组织化学特殊染色技术等。,一、组织病理学技术与细胞病理学技术,2、细胞病理学技术： 是以组织学为基础，研究组织碎片、细胞群团、单个细胞形态和结构以及细胞间比邻关系，并探讨组织来源的一门科学。 从阴道脱落细胞学到非妇科脱落细胞学，再到细针穿刺细胞学，巴氏理论和技术对恶性肿瘤和癌前病变的诊断起了重要作用。近年来，液基膜式薄层细胞学技术和液基离心沉淀式薄层细胞学技术代替传统的巴氏涂片，使宫颈低度病变和高度病变的检出率有了显著提高。,二、免疫荧光与免疫组化技术,1、免疫荧光技术： 通过荧光素标记抗体，并借助荧光显微镜观察荧光的发光物质，主要用于检查、鉴定、定位和示踪各种抗原或抗体成分。 广泛

4、应用于病原微生物检测、肾脏病变、血液病变、基因蛋白的研究，尤其是在病原微生物检测和肾脏病变的准确诊断方面发挥着巨大作用。,二、免疫荧光与免疫组化技术,2、免疫组化技术： 免疫组织化学也称免疫细胞化学，是应用标记抗体寻找组织细胞中抗原的方法来检测组织细胞中化学成分的技术。 目前，免疫组化染色技术已广泛应用于医学科研、临床诊断和鉴别诊断、肿瘤的生物学行为及分型与起源判断、靶向药物筛选、病原体检测等领域,三、分子病理学技术,自20世纪80年代以来，杂交瘤和单克隆抗体、分子克隆、核酸探针和分子杂交、基因组学、转录组学、蛋白组学技术将分子改变的信息与病理形态学密切结合，提供不同病理状态下更详细的分子谱，

5、在病理形态基础上观察疾病过程中分子表达的变化。由此逐步形成了病理分子学技术，并广泛用于疾病诊断和分类、靶向药物的筛选、病原体的检测、遗传学研究等。,三、分子病理学技术,1、原位多聚酶链式反应技术(PCR) 将在冷冻或石蜡包埋组织切片、细胞涂片中的核酸片段进行高效扩增，来检测细胞内单一拷贝或低拷贝的待测核酸序列。主要应用于病原体检测，内源基因检测，基因突变、基因重排和染色体易位。,三、分子病理学技术,2、原位杂交技术 用特定标记的已知顺序核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行复性、杂交并对其实行检测的方法，称为核酸原位杂交。 广泛应用于医学生物学研究，如基因定位、基因缺失、基因易位、特异基因、整

6、合检测等。,三、分子病理学技术,3、以地高辛或生物素标记的探针和酶的呈色反应进行检测的显色原位杂交技术（CISH） 将基因探针用地高辛或生物素标记，利用过氧化物酶或碱性磷酸酶的呈色反应在光学显微镜下检测组织mRNA的表达水平。CISH技术可用于检测基因扩增，染色体移位以及染色体计数。尤其在肺癌HER-2基因扩增的检测中得到了广泛应用，而且对对其他肿瘤如卵巢癌和乳腺癌等肿瘤的治疗和预后判断也有重要价值。,三、分子病理学技术,4、以荧光素标记的探针进行检测的荧光原位杂交技术（FISH） FISH是应用荧光素标记的探针与组织细胞中待测核酸反应形成杂交体，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察信号表达，广

7、泛应用于淋巴瘤、骨和软组织肿瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌等肿瘤病理诊断和对临床治疗反应的评估。,四、超微病理学技术,目前，电镜诊断技术已广泛应用于现代临床病理诊断，特别是在传统的临床诊断手段无法确诊的病例中发挥着重大作用。 应用于临床病理诊断中的主要是透射电镜和扫描电镜，前者注重细胞核内的超微结构，后者则用于观察组织和细胞的表面形态。,五、生物芯片技术,生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。 按照芯片上固化的生物材料的不同，

8、可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。序等。,五、生物芯片技术,目前应用比较广泛的是组织芯片技术和基因芯片技术。 组织芯片技术主要用于肿瘤病因学、肿瘤相关基因的验证、肿瘤分子分型及个性化治疗、肿瘤早期诊断及预后评估等。 基因芯片技术可用于基因表达谱分析、基因分型、基因突变和基因组的多态性的检测、新基因的寻找、遗传作图、重测序等。,六、显微切割术,显微切割术是在显微状态或显微镜直视下通过显微操作系统从冷冻或石蜡包埋组织切片、细胞涂片上的任一区域内切割下几百个、几十个同类细胞，或单个细胞甚至目标染色体，再进行有关的分子生物学方面的研究。 目前，激光捕获显微切割(LCM)是最

9、先进的组织纯化病理技术。LCM是基于病理形态进行细胞纯化，可较好地反映体内细胞的基因表达。激光捕获显微切割技术已经与PCR、蛋白质组学、组织微阵列技术和临床病理诊断工作等结合起来，为我们研究疾病的病因、发病机制、临床治疗提供更精确的服务。,七、激光扫描共聚焦显微术,激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)又称粘附式细胞仪，是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观测的对象进行数字图像处理的一套观察、分析和输出系统。 LSCM技术具有高灵敏度、高分辨率等特点，可进行定性、定量、定时、定位的分析测量。在形态学观察方面，可对标本各层分别成像，对活细胞行无损伤的“光学

10、切片”，有“显微CT”之称。LSCM在抗原表达、荧光定位、样本内部结构等形态观察方面有着无可比拟的优势。,八、比较基因组杂交,比较基因组杂交(CGH)是在染色体荧光原位杂交技术的基础上发展起来的一种新的分子细胞遗传学技术，它通过单一的一次杂交实验即可在整条染色体或染色体区带水平对不同基因组间DNA序列拷贝数的差异进行检测并定位。 目前CGH已应用于肿瘤发病的分子机制等方面的研究。,九、多光谱成像技术,多光谱成像技术是基于液晶可调谐滤波（LCTF）技术，可在不同波长处（420-720nm）检测荧光探针或染料在细胞或组织中的分布，可获取各种波长范围内的所有信号，通过光谱学的原理，可将每一种色原或染

11、料分离成单独的图像，完全去除样本的自发荧光，可明显提高组织切片成像的信噪比，还可将每种信号进行单独分离、定量，为多指标检测提供可行性，使之在病理诊断中有着很好的应用价值。,十、分子成像技术,广义“分子成像技术”是在细胞和分子水平上对活体内生物学进程进行描述和检测的一种手段。 除应用核素和磁共振探针成像外，结合光成像技术、生物发光成像技术、化学发光或荧光报告分子均可被用于追踪体内分子及细胞水平的生物活动（实时描述体内基因表达及相应的蛋白功能活性）。,十、分子成像技术,光成像技术可以通过检测报告基因的复制来纵向追踪疾病的进程，观测机体对治疗疗效的反应，以及组织和器官中干细胞的分化结局和命运。 荧光

12、分子成像技术用于对生物体内肿瘤的发生、转移、肿瘤血管生成及抗肿瘤药物治疗反应等进行实时、非侵入式、特异性跟踪和探测，可以从分子、细胞水平上研究肿瘤内发生的一系列生理病理学变化，为今后临床实践中进行肿瘤的早期诊断、靶向治疗、术中成像，以及抗肿瘤新药的研发，提供了有效的工具。,十一、生物信息学技术,采用计算机科学、信息技术和数学的理论和方法来研究生物信息的交叉学科。可进行生物学数据的研究、存档、显示、处理和模拟，包括高通量生物学数据分析、基因的功能注释和分类、蛋白质相互作用网络构建、根据网络的拓扑性质挖掘网络重要节点以及蛋白质及其突变体的空间结构分析与模拟、核苷酸和氨基酸序列分析，新基因的发现和蛋白质结构的预测等。 生物信息学技术在病理学研究的应用仍处于早期阶段，比如进行疾病相关基因的筛查