课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.ppt

1、专题2:微生物的培养与应用,课题二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,课题背景,1.尿素的利用:尿素CO(NH2)2重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用。,2.细菌利用尿素的原因：,CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3,细菌脲酶,课题目标,1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,尿素分子的立体结构,一、研究思路,（一）筛选菌株,1.实例：PCR技术(DNA多聚酶链式反应) ：一种在体外将少量DNA大量复制的技术。此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。,提出的问题如何寻找耐高温的DNA聚合酶？,解决问题的思路寻找耐高温环

2、境。,原因：高温条件淘汰了绝大多数微生物。,获得启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,2.实验室微生物的筛选原理：选择培养基,人为提供有利于目的菌株生长的特定条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。,课堂探究： 1、伊红美蓝培养基为什么是鉴别培养基而不是选择培养基？ 2、发生石油泄漏后，一些微生物可以有效的分解石油，如何配置选择培养基将这些微生物选择出来？,二、实验设计,土壤取样,样品稀释,土壤微生物大约70%-90%是 ，细菌在酸碱度接近 _ 的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约38cm的土壤层，因此取样时一定要铲 _ 。,细菌,中性

3、,去土表层,所选用的样品稀释范围要保证获得菌落数在 之间，适合计数。 细菌选用： 、 、 倍的稀释液进行平板培养； 放线菌选用： 、 、 倍的稀释液进行平板培养； 真菌选用： 、 、 倍的稀释液进行平板培养；,30-300,一万,十万,百万,一百,一千,一千,一万,一万,十万,制备培养基,微生物培养,注：不同的微生物 需要不同的培养温度和时间,微生物观察,观察菌落： 细菌合成的 将尿素分解成 ，使培养基的_ 增强，在以 为唯一氮源的培养基中加入 _ 指示剂培养细菌，若指示剂变 ，可确定该种细菌是能够 _ 的微生物，即目的微生物。 计数菌落： 每隔24h统计 数一次，最后选取数目 时的记录作为结

4、果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落数。,脲酶,碱性,尿素,氨,红,酚红,分解尿素,菌落,稳定,牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，判断选择培养基是否起到选择作用。,选用稀释倍数为103107的稀释液。每个稀释度下需要3个选择培养基（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要制备几个牛肉膏蛋白胨培养基和几个选择培养基？准备好无菌试管和移液管,碳源：葡萄糖、尿素,氮源：尿素,能。只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存。,3.选择培养基,问题3：该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？,问题4：此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,在微生物学中，将允许特定种类的微生

5、物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。,加入青霉素的培养基,概念：,细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长。,不加含碳有机物的无碳培养基,分离自养型微生物。,对应课堂探究 3和4题,5、两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,甲：没有重复实验（至少涂布

6、3个平板）。,乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值。,一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。,稀释涂布平板法计算注意事项：,学案预习（二）1、2,（二）统计菌落数目,2.间接计数（活菌计数法）,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(m)，M代表稀释倍数。,当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。,（2）原理：,稀释涂布平板法。,（1）常用方法：,计算公式：,每克样品中的菌落数(CV)M,【例7】某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的

7、平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL）（ ） A.2.34108B.2.34109 C.234D.23.4,（3）计数,B,（二）统计菌落数目,【解析】稀释倍数为106，0.1 mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每毫升样品中菌落数就为234/0.1106=2.34109。,微生物的培养、观察并记录结果,(一)无菌操作,1.取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。,2.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。,3.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。,(二）做好标记,注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。,（三）规划时间,三、操作提示,【课堂小结】,一、选择培养基的成分：,分解尿素细菌的分离与计数,尿素作为唯一的氮源。,二、鉴定方法：,在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素。,三、统计菌落数目的方法,（1）间接