专题5-课题3-血红蛋白的提取与分离.ppt

1、课题3 血红蛋白的提取和分离,本课题学习目标,体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。 1、主要概念：凝胶色谱法 电泳法 缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。 2、主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理 3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点： 样品的处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。,知识回顾-有关蛋白质的几个问题：,1、含量 2、组成元素 3、相对分子质量 4、基本组成单位： 结构通式： 种类： 5、氨基酸连接方式,占细胞干重的50以上，细胞中含量最多的有机物

2、,C、H、O、N (大多数含S),高分子化合物,氨基酸,脱水缩合,知识回顾-有关蛋白质的几个问题：,6、肽键结构式： 7、形成方式 8、蛋白质多样性的直接原因： (根本原因？) 9 、蛋白质的鉴定方法,细胞和生物体的结构物质，是一切生命活动的主要承担者。,氨基酸的种类、数目、排列顺序不同；多肽链的空间结构不同。,10、生理功能,DNA的多样性,根据蛋白质各种特性的差异， 如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。,问：依据什么来分离和提取蛋白质,基础知识,阅读并回答（P64） 1、凝胶色谱法另一个名称； 2、凝胶色谱法分离蛋白

3、质的依据； 3、凝胶的实质； 4、凝胶色谱法的原理。,基础知识（一） 凝胶色谱法,1、别名： 是根据 ，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用分离蛋白质的有效方法。,3、凝胶 性质：一些微小的 ，球内含许多贯穿的通道； 化学本质： 实例：,（一） 凝胶色谱法,2、依据的特性:,分配色谱法,相对分子质量的大小,蛋白质相对分子质量的大小,多孔球体,多糖类化合物,葡聚糖、琼脂糖,当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,较小,较大

4、,凝胶外部,较短,较快,分离出 的蛋白质。,相对分子质量较大,原理：,（一） 凝胶色谱法,4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程,凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示,1、缓冲物质有哪些？ 2、缓冲溶液的作用是什么？ 3、怎样配制缓冲溶液？,（二）缓冲溶液,1、缓冲溶液概念,在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。,能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维持PH基本不变。,2、缓冲溶液作用,基础知识（二）缓冲溶液,3、缓冲溶液配制,通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在

5、不同PH范围内使用的缓冲液。,思考：说出人体血液中缓冲液。,NaH2PO4 / Na2HPO4,H2CO3 / NaHCO3,在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）,1、概念：带电粒子在 的作用下发生迁移的过程。,电场,2、原理：许多重要的生物大分子，如 等都具有 ， 在 下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 、 的不同使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。,多肽、核酸,可解离的基团,正电

6、或负电,一定的PH,所带电荷相反的电极,带电性质的差异,大小,形状,迁移速度,(三)电泳,3、分类：,琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。,测定 通常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳,蛋白质相对分子质量,琼脂糖凝胶电泳示意图,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动,电泳检测结果,实验操作,阅读课本66页-67页相关内容，思考以下问题： 1、蛋白质的提取和分离一般分成几步？ 2、洗涤红细胞的目的是什么？怎样洗涤？洗涤干净的标志是什么？ 3、采用什么方法分离血红蛋白？离心分层后，各层的成分各是什么？用滤纸过滤，去掉什么成分？ 4、透析目的？,实验操作,样品处理粗分

7、离纯化纯度鉴定,1.样品处理：,（一）蛋白质提取和分离步骤,（二）操作过程,可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。,1、人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；猪牛羊（哺乳动物）成熟的红细胞无细胞核，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,血液,血 浆,血细胞,白细胞,血小板,红细胞 （最多）,血红蛋白 （90）,2、血液有哪些成分？,1、红细胞的洗涤,（1）洗涤的目的： （2）洗涤方法： （3）洗涤干净的标志：,除去杂蛋白（血浆蛋白）,上清液不再呈现黄色。,（一）样品处理,生理盐水,2、血红

8、蛋白的释放,在 和 的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。,1、红细胞的洗涤,（一）样品处理,蒸馏水,甲苯,3、分离血红蛋白溶液,（1）方法：,离心,（2）离心分层后，各层的成分,甲苯层,（3）滤纸过滤，除去 ， 于分液漏斗静置片刻，分出下层的 。,脂溶性沉淀层,脂溶性沉淀层,红色透明液体,取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h。,4.透析,问：透析过程及透析目的？,透析目的是：除去样品中分子量较小的杂质。,说明：透析袋是一种半透膜，能使小分子自由进出，而大分子不能通过。,（二）粗分离,4.透析,

9、实验操作 （二）粗分离,阅读课本P67-69，了解凝胶色谱的操作过程。,实验操作 （二）凝胶色谱操作,1、凝胶色谱柱的制作 2、凝胶色谱柱的装填 3、样品的加入和洗脱,2.实验操作 (1)样品处理：通过红细胞的洗涤、 、 等操作收集到血红蛋白溶液。 (2)粗分离：通过透析去除血红蛋白溶液中的 较小的杂质。 (3)纯化：通过 分离相对分子质量不同的蛋白质。 (4)纯度鉴定：用 进行样品纯度鉴定。,搅拌,离心,相对分子质量,凝胶色谱法,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,DNA粗提取与血红蛋白提取的比较,练习巩固,1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是 A 弄清各种蛋白质的空间结构 B 弄清各种蛋白质的功能 C 弄清各种蛋白质的合成过程 D 获得高纯度的蛋白质,2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是 A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质 D 二者根本无法比较,3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异 4、在采血容器中加入柠檬酸钠的