实验一-碱裂解法提取质粒DNA

1、实验1、碱解法提取和检测质粒DNA一、实验目的和原理介绍实验背景：质粒DNA的提取是基因工程操作中常用的基本技术。 质粒作为载体应该具有以下四个特征目的基因有足够的宽度，并且对携带的目的基因通过载体的复制和调控系统可以得到忠实的复制和增殖。不需要的DNA克隆区有多种限制性核酸内切酶单一识别位点，使基因片段和载体连接、重组和筛选更加容易。有与宿主细胞相同的一种或多种遗传表型(例如抗药性、营养缺陷型或显色表型反应等)。拷贝数多，宿主细胞DNA分离容易，分离纯化容易。分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：收集培养细胞扩增质粒的细菌，分离纯化降解质粒DNA。实验原理碱解法分离质粒DNA是基于染色体DN

2、A和质粒DNA的变性和复原性差异达到分离目的的。 强碱性pH下染色体线性DNA的氢键被切断，双螺旋结构解开变性。 质粒DNA的大部分氢键也被切断，但超螺旋共价键闭合的环状的2条互补链不能完全分离，如果将pH调节到中性，变性的质粒DNA再次恢复原来的结构，染色体DNA不能再结合形成网状结构，经过离心分离染色体DNA和不稳定的大分子RNA、蛋白质实验目的：掌握基因工程提取基因载体和最常用的提取质粒DNA的方法。2 .实验试剂1、Sol I 100 ml:1 mtr is-HCl (ph8.0)2.5ml、0.5M EDTA 2ml、DDW 91ml、20%葡萄糖4.5ml (葡萄糖单独消去，消去完

3、后加入soli )。2、Sol100ml:(新调、常温使用) 10% SDS 50ml、2M NaOH 50ml。 使用前将两种溶液混合。3、加入Sol 500ml:KAc 147g、HAc57.5ml、300mlDDW搅拌，定容至500ml。 高压灭菌，4保存。4，70 %乙醇无菌水DDW5、苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1 )氯仿使蛋白质改性，有助于液相和有机相的分离，异戊醇可以去除萃取中出现的泡沫。 苯酚和氯仿都有很强的腐蚀性，操作时请戴手套。三、实验程序将保存的9K质粒大肠杆菌克隆菌种以1/100的比例接种含有3 mL适当抗生素的LB培养基中，在37、180rpm下培养一晚或12小时

4、以上，使菌种活化(直至对数生长期)。 将活性菌种在1/100接种到200 ml的LB培养基中，在37、250rpm的剧烈振动下培养一晚。1 .离心管(10mL )分注菌10mL、离心上清(10000rpm、5min、4)； 丢弃上清，将离心管倒置在卫生纸上数分钟，尽量使液体流动。800l的冷Sol上悬挂的激烈菌体振动。加入solii1.6ml轻轻反转数次(动作轻，防止DNA碎片形成)，完全混合，室温下放置10min (由于solii是分解液，所以离心管中的菌液逐渐变干净)。4、加入1.2mL冷Sol后立即轻轻倒置，完全混合，放置在冰上10分钟。5，4，12000rpm离心10分钟。 solii

5、i是中和溶液，此时形成质粒DNA的复原性、染色体和蛋白质的不可逆变性、不可溶复合物，同时k使SDS蛋白复合物沉淀。6 .将上清收集到新的离心管中，加入等体积的苯酚/氯仿/异丙醇中，振荡混炼，使核酸沉淀，在室温下放置10分钟以上。 以12000rpm离心5min，将上清小心转移到新的离心管中。将体积预冷的乙醇酐加倍，搅拌，在室温下放置2-5min，离心12000rmp10min。8 .丢掉上清，打开管口倒在厕纸上，使所有液体流出，加入70%乙醇1ml洗涤1次使其沉淀，在12000rmp下离心5分钟。9 .吸取上清液，在厕纸上倒置软管，流入液体，在室温下干燥。10 .将沉淀物溶解在50l DDW中，储存