1临床生化检验-光谱分析技术.ppt

1、1,第一节 光谱分析技术,分光光度技术的基本原理,分光光度计的基本结构,分光光度计的操作方法,分光光度技术的定性和定量方法,韶关学院医学院 杨江勇,2,光谱分析技术原理：,利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。,光谱分析技术分类：,发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法,吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光 度法和红外光谱法,散射光谱分析技术：比浊法,3,一、分光光度技术的基本原理,（一）吸光度与透光度,A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I,当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分

2、光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即：,T = I/I0,T100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即：,4,（二）Lambert-Beer定律,Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层 厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其 表达式为：,A = KLC,式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液 层厚度，称为光径；C为溶液浓度,（Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。）,5,据Lambert-Beer定律，当液层厚度为cm

3、，浓度单位为mol/L时，吸光系数K称为摩尔吸光系数。其意义是：当液层厚度为1cm，物质浓度为1mol/L时在特定波长下的吸光度值，是物质的特征性常数。,6,（三）偏离Lambert-Beer定律的因素,应用Lambert-Beer定律产生误差主要来源于光学 和化学两方面的因素。,1光学因素： 要求入射光是单色光。入射光的谱带越宽，其误差越大。,2化学因素： 浓度、pH、溶剂和温度等因素可影响化学平衡。,7,二、分光光度计的基本结构,最常用的是可见分光光度计和紫外-可见光分光光度计,光源,单色器,比色杯,检测器,显示器,五大部份,结构：,8,（一）光源,光源定义：,指一种可以发射出供溶液或吸收

4、物质选择性吸收的光。光源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变化。,光源种类：,可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯。,紫外光光度计常用氢灯作为光源。,9,（二）单色器,定义：,将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分 光系统或单色器。,种类：,滤光片,棱镜,光栅,10,（三）比色杯,又称为吸收池或比色皿,材料：,常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成,（五）显示器,（四）检测器,检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号 放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。,是将光电管或光电倍增管放大的电流

5、通过仪表显示出来的 装置。,11,三、分光光度计的操作方法,（一）分光光度计的基本操作,以721-A型分光光度计为例，其基本的操作步骤为：,1.开721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子打开， 通电20分钟使仪器预热。 2.将波长旋至测定的波长。 3.将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液 置于光路中。 4.将开关置于T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光 量细调调节T为0.0,关上 比色池盖子，调节T为100.0。 5.将开关置于A，用消光调零调节A为0.0 6.重复步骤4和5 7.将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A）,12,（二）吸光度的校正,铬酸钾的标准液可用于校正分光

6、光度计的吸光度。在25，将4mg铬酸钾溶于100ml的0.05mol/L KOH中，放入比色池中，在不同波长下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进行比较，可检测仪器吸光度的准确度。,13,四、分光光度技术的定性和定量方法,（一）分光光度技术的定性方法,定性依据：,最大吸收波长max和摩尔吸光系数,2.摩尔消光系数方法,1.最大吸收波长max方法,14,（二）分光光度技术的定量方法,1.标准曲线法,根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，按最小二乘法的原理，将对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。,方法：,15,制作和应用标准曲线时应注意下面几点：,（1）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新 绘制。,（2）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。,（3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。,（4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。,16,2比较法,Cu=(AuCs)/As,己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白， 同时测定标准管