生物化学与分子生物学八年制课件27.ppt

1、第26章基因表达和功能分析的基本策略Strategies for analyzing Gene Expression and function，第一节基因表达的分析策略Strategies for analyzing Gene Expression，第一，通过检测mRNA来检测基因开放系统研究方法：可以发现和分析PCR、双向基因表达指纹、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等未知基因。这里主要介绍已知基因的一般表达分析方法。(1)可以用基于杂交原理的方法检测mRNA表达水平，并且可以分析mRNA表达，确认cDNA的新序列是基于RNA-DNA杂交原理的RNA分析技术。北压印分析原理的示意图。2核糖

2、核酸酶保护实验(ribonuclease protection assay，RPA)可用于MRNA定量和RNA剪接分析，是基于mRNA混合原理分析mRNA的方法，可以定量分析mRNA，研究结构特征，灵敏度和特异性都很高。核糖核酸酶保护实验原理示意图，对mRNA的区域定位，可以利用杂交原理建立的组织远端mRNA检测技术，将细胞或组织的中原表达的mRNA区域定位。也可以补充定量分析。设计与目标mRNA碱基序列互补的寡核苷酸序列，用探针标记。牙齿探针与目标目标序列特异杂交，可以检测标记信号，确认基因在组织和细胞内表达的位置信息。原位杂交功能提供的信息较少，但牙齿技术广泛应用于组织的基因表达分析。因为

3、高稳定性，广泛的目标，组织的适用性。3 in situ hybridization (ISH)，(in situ hybridization，ISH)，(in situ hybridization将mRNA作为模板在体外扩增cDNA，然后将cDNA作为模板转录特定基因RT-PCR技术通常用于RNA的定性分析。设定阳性参考，可以进行测定RNA样本的半定量分析。牙齿方法适用于样品测量的初步筛选，目前已被实时定量PCR广泛取代。mRNA中常用的定量分析实时定量多因素更改(real-time quantitative polymerase chain reaction，rq-PCR)是mRNA定量分析

4、的最常用、最快和最简单的方法，2实时定量PCR，当前实时定量PCR其中最经济、最简单的技术是将荧光染料(如SYBR Green)和双链DNA分子结合起来，利用发光特性表示放大物的增加。其他4茄子方法都有荧光染料标记的寡妇核苷酸，探针和正确的扩增子杂交，5核酸酶(如众所周知的TaqManTM)，分子信标，ScropionsTM，探针杂交法，它们具有更强的特异性，对PCR后溶解曲线的需求，后续SSS在蛋白质水平检测特定基因的表达活性时，最常用的方法是利用Western张力对细胞或组织中的总蛋白质中的特异蛋白进行定性和半定量分析。，(a)可以通过特异性抗体Western印迹直接测定基因编码多肽，并通

5、过蛋白质样品的制备SDS-页面分离蛋白转移膜特异性抗体(即第一抗体)和膜中的蛋白质(抗原)印迹杂交检测标记信号的第二抗体(即抗抗体，商品测试套件中)牙齿方法不需要分离将由传记影洞检查的样品蛋白质。相反，将样品预先包装在支撑体上，以后的反应过程将与Western印迹大致相同的顺序(即“吸附”)特异性抗体(一元)和与酶相连的第二抗体(事先抗体，“吸附”抗原)相结合，进行酶进行反应后，通过特殊酶标记仪测量和记录数据。(b)酶联免疫吸附分析与威斯特伦印迹原理相似，但形式不同。特征：特异性；灵敏度很高。稳定、易于操作、标本使用量小，适合大规模检查，特别适合在体液中检测微量特异性抗体或抗原。可以进行定性实

6、验，也可以进行定量分析。广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学、免疫学等领域。酶联免疫吸附分析，免疫组织化学(immunohistochemistry)利用与免疫细胞化学(immunocytochemistry)相同原理标记的特异性抗体，通过抗原抗体反应和显色反应，在组织或细胞原位置特定抗原(即目标蛋白)，(3)免疫组织化实验可以原位检查组织/细胞表达的蛋白质，(免疫荧光)应用荧光(倒置)显微镜或激光共聚焦显微镜(confocal microscopy)对靶分子进行定性、定量和定位分析，牙齿中抗体蛋白靶标使用双重着色或多重着色程序同时检测多个感兴趣的目标分子是揭示有关细胞群体功能和相互作用的更多

7、信息的有效方法。免疫组织主要通过定性、定位技术结合密度测量系统、图像分析系统等测量工具，可以获得定量数据。流式细胞术细胞水平分析特定蛋白质的基本原理也是抗原抗体反应。利用荧光标记抗体和抗原特异性结合，通过流式细胞术分析荧光信号，根据细胞表达特定蛋白质的水平判断特定蛋白质阳性细胞(即特定基因表现细胞)。(4)流式细胞术用于分析表达特定蛋白质的阳性细胞，流式细胞术可以检测活细胞或检测甲醛固定细胞。广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达水平的定量分析，可以根据多种蛋白质的表达模式区分细胞子集。流式细胞术还可以同时显示和监控多种荧光标记的多个抗体，是快速分析、分类和验证细胞特征的有效方法。第三，高吞吐量检

8、测技术成为基因表现研究的有力工具。高通量筛选(HTS)技术以大量核酸、多肽信息累积(即数据库)为基础，利用微板作为分子载体，形成集成的“筹码”。快速敏感，信息量大，适合大规模运营，因此被称为“痛苦量”。痛苦量检测技术适合于“组织学”研究，更适合于生命活动过程相关基因表达频谱分析。基因芯片是基因表现轮廓分析的常用方法基因筹码(gene chip)，也称为DNA微阵列(DNA microarray)、DNA筹码(DNA筹码)，是含有大量已知序列的核酸片段(包括寡居核苷酸、cDNA和基因组DNA)其中，基因表达频谱分析是目前基因芯片最常用的方面，主要采用cDNA芯片，基因表达频谱芯片使在生理和病理条

9、件等不同状态下基因表达谱比较容易，揭示了转换组差异表达的规律。(a)基因芯片和高通测量顺序技术可以在基因水平上对基因表达进行高剂量分析。2.高通量测量顺序技术是下一代基因表达频谱分析方法，高通量测量顺序技术可以一次连续测量数十万到数百万个DNA分子片段，从而快速获得转录组或基因组的全貌，也称为深度排序(deep sequencing)。在DNA水平上，可以大规模分析基因组甲基化、突变基因筛选、基因多态性检测等。可以在RNA级别扫描、定量和鉴定RNA片段，对整个基因组进行广泛的频谱表达研究。1)目前，高通测序技术不仅在DNA测序中发挥了重要作用，而且已应用于基因组分析的各个方面。2)高通路排序的

10、另一个广泛使用的领域是小分子RNA或郑智薰编码RNA(ncRNA)研究。测序方法可以轻松解决筹码技术检测小分子时出现的技术难题(短序列，高动员性)，小分子RNA的短序列与痛苦测量序列的长度很一致，同时测序方法可以在实验中发现新的小分子RNA。基因芯片的缺点：是只能检测被称为“封闭系统”的序列的特征(或有限变异)。痛苦测量顺序的优点：是“开放系统”，发现能力和寻找新信息的能力本质上高于筹码技术。(b)蛋白质芯片和二维传记电泳可以在蛋白质水平上分析基因表达的高量，蛋白质筹码(protein chip)是对蛋白质的表达和功能进行高吞吐量分析的技术。为了识别复杂生物样品溶液中的目标多肽，将具有高亲和力

11、特异性的探针分子(例如单克隆抗体)固定在基板上。蛋白质功能芯片可用于研究蛋白质修饰、蛋白质-蛋白质/DNA-蛋白质/RNA-蛋白质、蛋白质和脂质、蛋白质和药物、酶和底物、小分子-蛋白质等的相互作用。1蛋白芯片有多种形式和用途。蛋白质检测芯片包括：抗体筹码抗原筹码配体筹码碳水化合物筹码等。根据蛋白质筹码的制作方法和用途，1 .蛋白质检测筹码2。可以分为蛋白质功能芯片两个茄子主要类别。目前比较和鉴定蛋白质表达谱更多地使用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳结合质谱技术。二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，也称为二维传记电泳(简称two-dimensional electrophoresis，简称2-D传记电泳)。原理：

12、根据蛋白质分子的两个属性等电点和分子质量分离蛋白质混合物。传记游泳结果染色后，可以在其他样品中比较蛋白质的表达谱。从凝胶中切下特定的蛋白质点，通过胰蛋白酶消化，然后得到短肽片，还可以利用质谱技术进行定性分析，鉴定差异表达的蛋白质。可以同时分离数百种蛋白质。，二维传记游泳结合质谱普遍对蛋白质表达频谱的分析和感情，在第二节生物信息学中预测基因功能中应用BIO信息应用节目，1，生物信息学方法对基因功能注释，(1)序列比对对基因功能进行预测。序列比对是生物信息学最基本的分析技术之一，最常用的方法是将目的DNA或蛋白质序列与已知的DNA和蛋白质序列数据库进行比较，搜索目的序列和高度动员的功能牙齿已知的基

13、因或蛋白质，并用这些基因和蛋白质预测目的基因和蛋白质的功能。BLAST是本地匹配搜索工具，是用于选择查询序列以查找与用户输入的查询序列匹配的数据库项的序列比对主工具。BLAST是序列数据库搜索节目家族，包含许多特定用途的程序。BLAST序列数据库搜索节目家族，(2)使用生物信息学方法分析基因筹码数据。最常用的方法是差异表达分析(也称为基因表达差异分析)聚类分析差异表达分析的目的：确定两个条件下差异较大的基因，即两个条件之一的基因表达水平，消除各种偏差后，差异具有统计意义，在统计分析中计算T测试和方差分析：表示差异的置信度，分析差异是否具有统计意义。建模方法：确定两个条件下模型参数是否相等，从而

14、确定表达差异的重要性。差异表示分析常用的分析方法有三种。以聚类分析为基础的基本假设：如果组内的基因具有相似的表达模式，那么它们可能具有类似的功能，例如共同的转录因子调节基因。或者产品可以具有构成同一蛋白质复合体的基因，或者参与同一调节途径的基因等功能。在具体应用中，可以根据相似的表达谱聚类基因，预测组内未知基因的功能。多种群集方法已应用于基因筹码研究，如分层群集、k-means群集、自组织映射和其他目前，蛋白质的同源序列通过多序列比对收集，确定了存储在域和莫蒂夫等蛋白质结构内的大量保守区域或序列。这些孔刘领域和保守模式通常与特定的生物活性相关，反映了蛋白质分子的重要功能。(3)通过生物信息学方法分析蛋白质结构预测蛋白质功能，利用蛋白质序列模型搜索工具预测蛋白质功能的方法是首先收集现有蛋白质家族，构建模型数据库。然后通过数据库搜索检查查询序列中是否存在可能的序列模型，以确定该序列是否属于已知蛋白质家族之一。然后根据蛋白质家族已知功能预测未知蛋白质的功能。常用的模