Feulgen-Rossenbeck 改良的DNA法.ppt

1、Feulgen-Rossenbeck改良的DNA法,脱氧核糖核酸通过盐酸水解，第一步从DNA的脱氧核糖核酸残基分解出碱基，第二步在脱氧核糖残基的第14位碳键处打断糖苷键而游离出醛基，游离出来的醛基即与无色复红液（Schiff试剂）反应形成紫红色的复合物而把DNA显示出来。Schiff试剂配制 同PAS反应,作用原理,操 作 步 骤,结果 DNA呈紫红色，胞质呈浅绿色。 注意事项 新鲜组织染色效果较好。 以Carnoy液固定的组织染色效果较好。 最佳水解时间随所用固定方法而异。如用无水乙醇固定，水解时间为5min，如用Carnoy液固定则水解时间为8min。 在配制Schiff试剂时，要求活性炭

2、质优而量少，每100mlSchiff试剂应少于300mg，接触时间不得超过2min，以免被SO2漂白；用布氏漏斗、粗滤纸或玻璃丝快速过滤。, 1NHCl应预热到60。 有些碱性复红含杂质太多，亚硫酸氢盐不能使复红脱色，不能用于配制Schiff试剂。 偏重亚硫酸盐如保管不佳，潮解或硫味不足，则不能使复红脱色。 盛Schiff试剂的瓶子不宜过大，避免SO2逸出而留在瓶内无液体的空间。 要特别注意Schiff试剂贮存过程中SO2的丧失及试剂PH值改变。染色深度（及其分光性质）严格取决于所用试剂的PH值。,过碘酸-Schiff反应,作用原理 糖原、多糖和糖蛋白等都可用过碘酸-Schiff反应（PAS反

3、应）来显示。其原理是通过过碘酸的氧化作用，将糖分子中的碳键打断，游离出醛基，与无色碱性品红反应显示出红色。 试剂配制 过碘酸氧化液 高碘酸0.5g，蒸馏水100ml。此液溶后冰箱中待用。 Schiff液 碱性复红 1g 1N盐酸 20ml 偏重亚硫酸钠 1g 双蒸馏水 200ml 先将200ml双蒸馏水煮沸，稍有火焰，加入1g碱性复红，再煮沸1min。冷却至50加入20ml1N盐酸，待35时加入2g偏重亚硫酸钠。室温中2h之后见稍带红色，5h之后变为无色液体。棕色瓶内装好，封口，放入冰箱中保存待用。,染色过程 组织切片，脱蜡至水； 蒸馏水洗； 入过碘酸氧化液1020min； 充分蒸馏水洗； S

4、chiff液染色10min（如果室温在15以下可稍加温以加快反应）； 流水冲洗10min（对着色较深颜色的切片可缩短时间）。 可用Mayer明矾苏木素液染核35min； 0.5%盐酸乙醇分化； 无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。,结果 PAS反应阳性产物呈红色，细胞核蓝色。 注意事项 为避免多糖类物质溶解，不用水溶性固定剂。对于糖原的 固定，则需选用Carnoy等固定液。 偏重亚硫酸钠需质量优良，不能使用陈旧无硫的刺激性气 味的药品。 染了Schiff液后，不可用自来水冲洗过久，防止返红。应 注意切片变红适中后立即封片。,Feulgen 反应显示脱氧核糖核酸 （1）原理；脱氧核糖核酸经1

5、N盐酸在60水解，破坏嘌呤和脱氧核糖之间的配糖键而形成醛基，再与无色的Schiff试剂结合使其还原，形成具有醌结构的红紫色化合物即脱氧核糖核酸（DNA）。 （2）操作步骤： 1)取23毫米厚的组织块，固定于Carnoy或10% 甲醛等液均可。 2)石蜡切片、脱蜡至水。 3)入1N盐酸60 60分钟水解。 1N盐酸的配制：用比重1.19浓盐酸82.5毫升，加蒸馏水到1000毫升即成。 盐酸水解的时间，随所用的固定剂不同而别。（见Bauer表） 4)蒸馏水洗。 5)入Schiff氏试剂中反应30分钟至1小时。 取0.5克碱性品红（Basic uchsin）溶于100毫升煮沸的蒸馏水（用三角烧瓶）时

6、时摇荡，煮5分钟，使之充分溶解。冷至50时过滤加10毫升1N盐酸。冷至25时加0.5克偏重亚硫酸钠或钾或无水亚硫酸氢钠，放入棕色瓶于暗处静放24小时，有时需23天，应由紫红色变为淡黄色，置于暗处，密封瓶口，冰箱内可保存数月。若24小时后颜色过深可加活性炭0.5克摇匀脱色1分钟，用粗纸滤过保存。 6)切片用自来水洗，洗去多余的染液。冲洗前切片呈淡红色，冲洗后颜色可以加深。 7)脱水、透明、树胶封片。 （3）结果：DNA呈紫红色。,（4）注意事项 1) 新鲜组织染色效果较好。 2) 以Carnoy液固定的组织染色效果较好。 3) 最佳水解时间随所用固定方法而异。如用无水乙醇固定，水解时间为5min

7、，如用Carnoy液固定则水解时间为8min。 4) 在配制Schiff试剂时，要求活性炭质优而量少，每100mlSchiff试剂应少于300mg，接触时间不得超过2min，以免被SO2漂白；用布氏漏斗、粗滤纸或玻璃丝快速过滤。 5)1NHCl应预热到60。 6) 有些碱性复红含杂质太多，亚硫酸氢盐不能使复红脱色，不能用于配制Schiff试剂。 7) 偏重亚硫酸盐如保管不佳，潮解或硫味不足，则不能使复红脱色。 8) 盛Schiff试剂的瓶子不宜过大，避免SO2逸出而留在瓶内无液体的空间。 9) 要特别注意Schiff试剂贮存过程中SO2的丧失及试剂PH值改变。染色深度（及其分光性质）严格取决于

8、所用试剂的PH值。,过碘酸-Schiff反应显示糖类 作用原理 糖原、多糖和糖蛋白等都可用过碘酸-Schiff反应（PAS反应）来显示。其原理是通过过碘酸的氧化作用，将糖分子中的碳键打断，游离出醛基，与无色碱性品红反应显示出红色。 试剂配制 过碘酸氧化液 高碘酸0.5g，蒸馏水100ml。此液溶后冰箱中待用。 Schiff液 碱性复红 1g 1N盐酸 20ml 偏重亚硫酸钠 1g 双蒸馏水 200ml 先将200ml双蒸馏水煮沸，稍有火焰，加入1g碱性复红，再煮沸1min。冷却至50加入20ml1N盐酸，待35时加入2g偏重亚硫酸钠。室温中2h之后见稍带红色，5h之后变为无色液体。棕色瓶内装好

9、，封口，放入冰箱中保存待用。 染色过程 组织切片，脱蜡至水； 蒸馏水洗； 入过碘酸氧化液1020min； 充分蒸馏水洗； Schiff液染色30min（如果室温在15以下可稍加温以加快反应）； 流水冲洗10min（对着色较深颜色的切片可缩短时间）。 0.5%盐酸乙醇分化； 无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。 结果 PAS反应阳性产物呈红色。,汞-溴酚篮法显示蛋白质 1) 固定与切片 10福尔马林等各种固定剂均可（避免用锇酸液固定），石蜡切片。 2) 切片按常规脱蜡，经下行酒精入水。 3) 用汞-溴酚篮液染色15分钟至2小时。 4) 0.5%醋酸水溶液换洗3次，各5分钟。 5) 直接入叔丁

10、醇（Tertiary-butylalcohol）1分钟。 6) 再在叔丁醇内换23次，共3小时或过夜。 7) 二甲苯透明，封片。 结果：所有蛋白质均染成灰蓝色。 （2）坚牢绿法显示碱性蛋白质 1) 10%中性缓冲福尔马林液固定36小时，石蜡切片。 2) 切片下行入水，流水冲洗0.52小时。 3) 新配5%三氯醋酸（Trichloroacetic acid, TCA）盛于染色缸，在沸水浴升温后15-20分钟。 4) 在冷5%三氯醋酸漂洗，再换蒸馏水洗3次，每次5分钟。 5) 坚牢绿染液内，室温染色30分钟。 1坚牢绿（Fast green FCF） 10ml 0.005M磷酸二氢钠（NaH2PO

11、4H2O）缓冲液，调pH8.08.1 90ml 6) 蒸馏水漂洗。滤纸沾干后直入95酒精25分钟。 7) 换无水酒精2次，每次5分钟，二甲苯透明，合成树脂封片。 结果：碱性蛋白质呈蓝绿色。,苏丹法显示脂肪 （1）取新鲜组织于10%甲醛固定，冰冻切片； （2）经50%酒精数分钟； （3）入苏丹染色液中1530分钟（放置56600C温箱中）， 苏丹0.20.3 g溶于70%酒精100 ml，放置600C温箱中1小时，冷后过滤，用时取20 ml加蒸馏水23 ml； 50%70%酒精洗片刻，蒸馏水洗； Hansen氏苏木精染细胞核，水洗； 纯甘油透明，湿性封片。 结果：脂肪呈深桔黄色，细胞核蓝色，胆脂

12、素呈淡红色，脂肪酸不染色。 此方法为最常用的脂肪染色法，对各种组织均适用。,涂片法（吉姆萨染色） （观察血细胞） 1试剂配制 Wright染液的配置： Wright粉剂 0.1g 甲醇 60ml 将粉剂置于碾钵内，充分研磨，越细越好。将甲醇逐步加入碾钵内，边加边碾直至粉剂全部溶解。置于试剂瓶内密封保存，一周后可用，一月后效果最佳。 磷酸盐缓冲液（pH7）： 0.2M磷酸二氢钠(acid sodium phosphate) 19.5ml 0.2M磷酸氢二钠(disodium phosphate) 30.5ml 蒸馏水 50ml。 2染色程序 将涂好的血片，用蜡块划出染色区，以防染液溢流； 将涂好的血片平放在桌上，滴加Wright染液至恰好布满所划范围内的血膜，染色约2min； 加入等量的磷酸盐缓冲液（pH7）或蒸馏水，染色约3min，倾去涂片上的染液，以蒸馏水冲洗，待洗净染液至血膜呈淡红色