乳酸菌的抗噬菌体机制.ppt

1、乳酸菌抗噬菌体机制,乳酸菌噬菌体种类及特征 噬菌体侵染乳酸菌过程 乳酸菌中的宿主防御系统 控制噬菌体措施可行性分析 问题与展望,乳酸菌噬菌体种类,噬菌体同其他类型病毒一样，对宿主细胞有着很强的依赖性和专一性。乳酸菌类型的纷繁复杂，必然导致其噬菌体种类的复杂性。 根据乳酸菌噬菌体尾部形态，可分为三类：Myoviridae，Podoviridae，Siphoviridae。,乳酸菌噬菌体种类,Myoviridae：具有复杂的可收缩的尾 Podoviridae：具有短的、非收缩性的尾 Siphoviridae：具有长的、非收缩性的尾 乳品生产中最常见的是属于Siphoviridae的936型、c2型

2、和P335型噬菌体，前两者有很强的裂解性及较广泛的宿主范围。,乳酸菌噬菌体的形态,LAB噬菌体的头部大小基本相同，形态为正多面体或椭圆型，尾部一般有不能伸缩和能伸缩两种状态。,乳酸菌噬菌体的基因组成,LAB噬菌体DNA均为dsDNA，很少有非编码基因。 基因大小为18-55kb（也有的可达134kb）。较小的噬菌体的基因组通常有基因重叠的现象。 GC含量37（乳球菌）48（干酪乳杆菌）,已确定的噬菌体的基因组以及有重要功能的基因序列,噬菌体侵染乳酸菌过程,同其他病毒入侵细胞过程基本相同，乳酸菌烈性噬菌体从最初接触菌体到最终释放也经历了吸附、DNA侵入、复制及装配、释放四个基本过程。,吸附,首先

3、噬菌体与菌体表面发生非特异性吸附，这一过程易受外界条件如温度、pH等的影响，有可逆性；随后噬菌体尾部与菌体表面受体间发生特异性共价结合。,该过程不可逆，是决定噬菌体宿主特异性的主要因素。,乳酸菌噬菌体的溶原和溶菌感染过程,乳酸菌中的宿主防御系统,针对噬菌体增殖的过程，宿主细胞的自然防御措施也相应的分为四类。 1）干扰噬菌体吸附 2) 阻止噬菌体DNA的注入 3）限制修饰（R/M）系统 4) 流产感染系统,乳酸菌的宿主防御系统,装配和包装,蛋白质合成,m,m,DNA复制,噬菌体吸附,R/M系统,干扰噬菌体吸附,阻止噬菌体DNA的注入,流产感染系统,干扰噬菌体吸附,噬菌体吸附于乳酸菌体表面随机分布

4、的特异性位点或者受体。目前观察到了许多由于受体缺失或被掩盖而阻止噬菌体吸附的例子。 有两种机制导致了这种现象：由乳酸菌染色体突变产生的噬菌体不敏感株（BIMs）及由质粒介导的抑制噬菌体吸附机制。,干扰噬菌体吸附,BIMs抑制噬菌体吸附机制：宿主中编码细胞壁上同吸附相关的碳水化合物和部分质膜蛋白质的基因发生了突变。 质粒的抑制噬菌体吸附机制： 合成细胞表面抗原，产生碳水化合物。,干扰噬菌体吸附的乳球菌质粒,阻止噬菌体DNA的注入,噬菌体成功吸附到细胞表面的受体后，噬菌体与质膜间发生了耗能、依赖钙离子、不可逆的相互作用，使噬菌体DNA进入细胞质。 有研究表明一种膜蛋白Pip（phage infec

5、tion protein）分离自Lactococcus lactis ssp. Lactis C2，同噬菌体吸附有关。推断它具有一个跨膜区，且在氨基末端有一个分泌信号。它的自发突变体能够阻止噬菌体DNA的注入。 质粒编码的噬菌体注入阻止系统：pNP40，基因座没确定。,限制修饰系统（R/M系统）,宿主细胞内至少存在两种酶：限制性内切酶（R）及甲基化酶（M）。进入宿主细胞的噬菌体DNA大部分被限制酶水解掉，而自身DNA由于被甲基化酶修饰而免于被水解。 事实上许多噬菌体DNA在面对这样的宿主防御系统时会产生许多应急策略，如酶切位点的减少、碱基的修饰、产生抑制宿主限制性内切酶活性的蛋白甚至获得甲基化

6、基因。,限制修饰系统（R/M系统）,迄今为止已经发现了30种左右限制修饰基因，其中绝大部分位于某些质粒上，少部分位于染色体上。Wilson及Murray于1991年根据酶结构的复杂性和DNA序列将R/M系统分为四类：I型、 II型 、III型和IV型R/M系统。,限制修饰系统（R/M系统）分类,限制修饰系统（R/M系统）的作用,R/M系统的多样性以及它们质粒之间的交联，表明它们可以自发的发挥作用，而且可以通过系统组合而获得更高的噬菌体抗性。 有研究表明，RM系统能够影响质粒的整合和原生质体转化频率。,流产感染系统,此系统可以全面干扰噬菌体复制、转录、翻译、包装等过程，能导致受侵染细胞提前死亡、

7、噬菌体不能成熟释放，发生流产感染。 迄今为止已经发现了20多种Abi基因，根据它们在噬菌体DNA复制以前或以后作用，将其分为早期和晚期系统。 同RM相似，大多数为质粒编码，少数为染色体编码，如AbiH和AbiN基因，即分别是从L.lactis ssp.lactis和L.lactis ssp.cremoris的染色体上发现的。,控制噬菌体措施可行性分析,减少噬菌体危害的传统方法 现代的基因工程方法,减少噬菌体危害的传统方法,GMP体系应用：包括优良菌种的应用、培养过程的严格消毒、封闭发酵罐等方法。 抑制噬菌体培养基的应用：这些培养基中含有磷酸盐或柠檬酸盐等可以结合Ca2+的物质，能阻止噬菌体的吸

8、附；也有人研究了对培养基进行热处理和添加生物素对噬菌体生长的影响，有一定的参考意义。 抗噬菌体突变株（BIMs）的选育：由暴露在高水平噬菌体环境中的菌株自发突变形成，通常在编码受体的基因位点发生变异所致，可以明显的阻止噬菌体DNA进入宿主细胞。但由于这种突变体的抗噬菌体范围狭窄、易发生回复突变、产风味特性易变异等缺陷而限制了其应用。,一些有效的现代方法,接合性质粒的应用 基因重组 反义RNA技术,接合性质粒的应用,某些乳球菌的接合性质粒能有效的阻止噬菌体吸附，并且还含有食品级的选择性标记。 分离自L. lactis DRC3 的pNP40 流产感染（ AbiF，AbiE）和阻止噬菌体DNA注入

9、 编码镉抗性 分离自L. lactis DPC3147 的pMRC01 流产感染 编码乳链球菌素抗性,基因重组,编码I型RM系统中的hsdS的质粒转移：将仅含有编码hsd基因的质粒，转移到含有不同的hsd基因座的乳球菌中，可以使宿主细胞获得新的R/M特性，这种方法更适合用来防御突变的噬菌体的侵染。 噬菌体编码的抗性系统：一种类似于流产感染的、可利用噬菌体复制起始基因ori来控制噬菌体繁殖的系统。,噬菌体编码的抗性系统,重组体同复制因子大量结合，从而导致同噬菌体结合的复制因子的减少抑制其复制,X,X,X,DNA 复制,结合位点,宿主/噬菌体 蛋白质,噬菌体复制起始,X,X,质粒 DNA 噬菌体

10、DNA,ori,将噬菌体复制起始基因ori连接到高拷贝质粒上导入乳酸菌中，当外界噬菌体侵入时，由于质粒上的噬菌体ori比单独的噬菌体ori有更好的结合复制因子的能力，导致质粒的大量拷贝限制了噬菌体的繁殖。,复制因子,反义RNA技术,它利用噬菌体非编码链，通常是保守基因的转录。将反义DNA与可大量增殖的表达载体相连，然后使其在宿主细胞中大量扩增，表达出的反义RNA与侵入宿主的噬菌体DNA或mRNA相配对，达到抗噬菌体目的。,反义RNA的作用机制,I类，这类反义RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列或编码区，引起翻译的直接抑制；或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNAIII的敏感性增加，使

11、其降解。 II类：这类反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合，从而抑制靶mRNA的翻译功能。其作用机制尚不完全清楚，可能是反义RNA与mRNA的上游序列结合后会引起核糖体结合位点区域的二级结构发生改变，因而阻止了核糖体的结合。 III类：这类反义RNA直接抑制靶mRNA的转录。,反义RNA的作用机制,反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合后引起核糖体结合位点区域的二级结构发生改变，因而阻止了核糖体的结合。,反义RNA技术的局限性,它要求在设计反义链之前对目标噬菌体的基因序列有所了解。 抗噬菌体效果同选择的噬菌体DNA序列和此基因序列的转录水平以及转录产生的反义RNA的浓度相关。