生物技术制药复习资料 (熊宗贵)

1、第二章生物医学概论1.生物医药生产原料选择的主要原则，生物医药的特性及种类。主要原则：有效成分含量高，原料新鲜。来源丰富，容易得到。原料的产地比较近。杂质含量少。原材料成本低。容易萃取。特性：(1)药理特性：治疗的可行性强。药理活动高。毒性小的副作用，营养价值高；生理副作用经常发生。(2)生产准备的特殊性：原料有效物质含量低。稳定性差。容易腐败。注射剂有特殊要求。(3)检查上的特殊性：必须有理化检查指标和生物活性检查指标。分类：按药物化学本质和化学特性分类：(1)氨基酸和基诱导物流(2)多肽和蛋白质类(3)酶和辅酶(4)核酸和分解物及诱导物流(5)糖类(6)地质(7)细胞生长因子类(8)按原料

2、来源分类：(1)人体组织(2)动物组织(3)植物组织(4)微生物(5)海洋生物源药。按生理功能和用途分类：(1)治疗药(2)预防药(3)诊断药(4)其他。2、生物药物提取和分离制备方法工艺过程。提取生物药物时选择提取试剂时应注意的问题。工艺过程：1，生物药物原料选择、预处理和保存(保存方法：冷冻法，-40；有机溶剂脱水方法；防腐剂保存，多用于液体)。2.生物医药提取：(1)生物组织和细胞分裂：研磨法、压力法、反复解冻法、超声波振动破链法、自溶法、酶溶法(2)选择适当的溶剂进行提取(考虑提取剂的使用、提取时间、提取次数、温度)3.生物药物的分离纯化：(1)蛋白质类的分离纯化：沉淀法、亲和层析法、

3、疏水层析法(2)核酸类的分离纯化：萃取法、发酵法(3)糖类：沉淀法、离子交换层析法(4)地质选择试剂：1，需要提取的有效成分的溶解度高，杂质低。2、郑智薰破坏有效成分。3、有助于后续预处理。4、对环境的影响较小，有利于回收和处理。5、设备要求不高。6、低廉的费用。对人体无害是最好的。第三章基因工程约束第一，基因工程约束的主要工艺过程。目的获得基因重组质粒组成构建基因工程菌(或细胞)培养工程菌产物的分离纯化质量管理产品检验包装什么是目的基因？有多少茄子获得方法？用于构建基因工程菌的目的基因应满足什么要求？目的基因不仅是人们需要的特定基因，也是通常接受目的基因的细胞或个人原本没有的基因。获取方法：

4、(1)直接从有机体中提取总DNA，构建基因库，并调用其中的目的基因。(2)用mRNA作为模板，逆转互补的DNA片段。(3)聚合酶链式反应(PCR)特异性增强所需的目的基因片段(4)化学合成方法；逆转录(rt)-PCR合成cDNA。基本要求：不包含不必要的干涉成分，纯度高。适用于分段大小重建操作。结构，顺序正确，达到一定数量。第三，基因工程复制细胞和表达细胞、复制载体、表达载体的各自特征。复制载体：1，具有复制原点，必须能够在宿主细胞内自行复制。2、有一个或多个用于过滤的复选标记。3.具有适当限制性核酸内切酶的单个识别点。4、有更高的份数。表达载体：要在宿主细胞中表达复制基因，就必须把它放入具有

5、基因表达所需的各种调节因素的载体中。牙齿载体成为表达载体。表达载体的结构比复制载体复杂。除了与复制载体相同的复制原点、多个复制部位、过滤标记基因外，还需要控制启动子、转录终止符等目的基因表达的调节序列。第四，目的基因的高效表达是什么？如何全面提高目的基因的表达水平？有什么措施吗？目的基因的高效表达：1.目的基因的不溶性和高效表达。表达的蛋白质经常形成不溶性的无生物活性包涵体，需要溶解和报复才能获得活性目的蛋白。目的基因的高效可溶性表达。水溶性目的蛋白本身往往具有生物活性，是在没有复杂的变性复性分离过程的情况下提高目的基因表达的新策略。目的基因的高效分泌表达。目的基因的分泌型表达有两种茄子情况。

6、目的蛋白分泌为细胞株质，目的蛋白转移到细胞株质后分泌到细胞外。对于细胞外分泌的表达系统，可以进一步简化产物分离工艺。目的提高基因表现水平的措施：1.改造基因工程宿主菌。上游阶段改造宿主遗传性能，减少或消除乙酸生成，改造大肠杆菌，使其在贫氧条件下生长。提高工程菌的质粒稳定性。如果在上游阶段质粒建设时插入抗生素耐药基因，则在构建质粒时需要添加名为par和cer的比特。par位在细胞分裂中使质粒分布更均匀，cer位防止形成多体质粒，从而提高源中质粒的稳定性。下游阶段可以采用细胞生长期和诱导表达期分离的分段培养策略，培养条件循环控制策略和固定化细胞培养等。3.选择可高密度表达的宿主菌，将重组菌培养成高

7、密度。选择培养时，如果选择菌体密度和表达水平尽可能高的宿主菌。下游阶段工程菌的生长和产物表达的最佳环境条件。减少乙酸和其他抑制副产品的形成。如果在下游阶段设计好培养基的构成；请选择适当的比率增长率。适当降低培养温度。有限的流动和葡萄糖；同时进行基因工程细菌培养和乙酸分离。5.目的选择提高蛋白质表达质量的宿主菌和目的蛋白表达质量的方法。如果在上游阶段尽量不生产或少生产能引起蛋白质变性或分解的酶系宿主细胞。下游阶段可以采用分离菌体生长和蛋白质表达时间的策略。(也可分为上层和下层，如下所示：上游-基因工程宿主细菌的转化；提高工程菌的质粒稳定性。选择可以进行高密度表达的宿主细菌。目的选择可提高蛋白质表

8、达质量的宿主细菌。提高下游-工程菌的质粒稳定性。高密度培养对重组细菌；减少乙酸和其他抑制副产品的形成。目的选择提高蛋白质表达质量的方法。)，以获取详细信息第五，工程菌的稳定性及其影响因素和考察方法。基因工程细菌的遗传不稳定性主要表现在质粒重组的不稳定性。牙齿不稳定性表现为以下两种茄子表现形式：1.结构不稳定性：在重组DNA分子的特定区域中缺失、重排、修改，导致表观生物学功能丧失。2.分配不稳定性：整个重组DNA分子逃离受体细胞。影响基因工程细菌稳定性的因素：遗传特性：1。载体的选择2。选择宿主3。外源基因整合在宿主染色体上发酵工艺：1。培养基2。增长率3。限制机制4。温度5.pH和溶解氧6。外

9、源基因表达第六，基因工程细菌的一般培养方法及其特点是什么？连续发酵对大规模生产基因工程产品有什么好处？影响基因工程细菌发酵的因素。基因工程菌建设和基因工程菌产生发酵研究的目的、意义及相应的研究内容。培养方法：分批培养，补充材料分批培养，连续培养，透析培养，固定化培养。补液分批培养在发酵反应器中培养种子，随着时间的推移，间歇或连续添加新鲜培养基，培养使菌体进一步生长的培养方法。连续培养在种子收购发酵反应器中混合到特定的菌体浓度后，启动饲料和原料的蠕动泵，调节一定的稀释率，持续培养。透析培养透析培养是利用膜的反渗透原理分离代谢产物和培养基，从培养液中去除代谢产物，消除对生产菌的不利影响。固定化培养

10、即将固定化技术应用于基因工程细菌培养。基因工程菌固定化后，质粒稳定性大大提高，便于持续培养。尤其对分泌型菌更有利。持续培养可以为微生物提供一定的生活环境，调节其比例增长率，为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等提供良好的条件。在连续培养中，可以分离工程菌的生长阶段和基因表达阶段，进行两阶段连续培养，通过诱导水平、稀释率、细胞比例等三茄子参数优化，确保一阶段培养时的质粒稳定。在第二阶段，可以达到最高表达水平或最高生产率。影响基因工程细菌发酵的主要因素：1、徽章的影响。2、疫苗接种的影响。3、温度影响。4、溶解氧的影响。5、诱导时机的影响。6、柔道表达程序的影响。7

11、、pH影响基因工程发酵研究内容：1，宿主菌选择：徐璐不同宿主菌对外源基因表达的影响研究2，基因工程菌生长曲线测定3发酵条件外源基因表达的影响4，重组质粒稳定性研究。7.用包涵体表达的基因工程药物的分离纯化过程和方法分离纯化活性蛋白的一般程序及其操作要点。进行与分离纯化研究相关的研究项目及内容。流程方法和操作要点：1.菌体细胞的收集和粉碎(尽量提高菌体粉碎率，保持包涵体的完整性)。2.包涵体的分离、洗涤和溶解(通过离心法将包涵体与上清液中的碎片及杂质蛋白分离，包涵体清洗的基本原则是杂质清除率尽可能高，不溶解包涵体的目的蛋白)。溶剂型试剂选择的基本原则是对目的蛋白的溶解性强，选择性好。保护蛋白质的

12、生物活性。安全；安全。适用于后续各种操作。费用低)。3.变性蛋白的纯化(对包涵体萃取物采用柱层分析、凝胶过滤、离子交换层分析、HPLC等进一步分离纯化)。4、蛋白质的复性(恢复可用性和生物活性，影响因素：蛋白质浓度、杂质含量、冲击折变速度、氧化还原剂的使用和比例、再折叠配体的混合、温度、pH、离子强度等)。分离纯化研究：1.噬菌体研究：噬菌体方法及条件研究，镜检查评价粉碎效果，原则是尽量提高菌体破碎率，保持包涵体的完整性2、包涵体的分离和清洗研究：(1)对包涵体分离时的离心力和时间的思考；(2)洗涤剂及其他浓度和使用情况的研究；(3)洗涤时间和温度研究。包涵体洗涤工作的基本原则：(1)洗涤剂杂

13、质清除率尽可能高，但包涵体的目的蛋白不溶解。(2)分离包涵体时的离心力和离心力时间尽量满足包涵体和细胞碎片等杂质的分离。3、目的蛋白的变性(提取)研究：(1)变性及其浓度、使用情况的研究；(2)变性工作时间和温度研究；(3)变性工作后的固体分离(离心力和离心力时间)研究。4.变性蛋白的纯化研究：对包涵体提取物，可通过柱层分析、凝胶过滤、离子交换层分析、HPLC等方法进一步分离纯化。Ps:重组蛋白的纯化可以在包涵体溶解后或复性后进行，因此还必须进行两种茄子方法的比较研究。5.变性蛋白的腹水性研究：徐璐不同腹水性方法对目的蛋白腹水性效应的影响。主要调查蛋白质回收率及其对复性程度的影响。还需要调查蛋

14、白质浓度、杂质含量、重新折叠速度、氧化还原剂的使用量和比例、重新折叠配体的混合、温度、pH值、离子强度等对复性效果的影响。6.目的蛋白质的高度纯化研究：通过对再复性后获得的目的蛋白的高度纯化，可以满足不同的要求。8.基因工程药品质量管理的必要性和质量管理的要点，基因工程药品最终产品的品质管制特征和要点。需要：1.利用获得细胞作为表达系统准备产品。得到的蛋白质往往具有分子量、大而复杂的表达结构。2、许多基因工程药物参与了人体某些生理功能精密的蛋白质，以极微量的差异产生明显的效果。3.宿主细胞中表达的外源基因在翻译、转录及工艺扩大过程中发生变化。品质管制要点：1、原料的品质管制。确认编码药物的DN

15、A序列正确，重组微生物来自单个克隆，使用的质粒纯净稳定。2、生产品质管制。远视细胞仓库生产，有限一代生产，连续培养生产，分离纯化。3、最终产品品质管制。产品的鉴别、纯度分析、生物活性测定、安全稳定性考察及产品一致性保证。品质管制特性：任何单一的分析方法都不能满足这些产品的测试要求。必须将生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学、分子生物学等多种学科理论和技术集成在一起，才能确保基因工程产品的安全和有效性。第四章酶工程约束一、酶工程约束的主要内容1，药用酶的生产：发酵生产，分离纯化，分子修饰2，酶约束：酶催化反应，固定化，郑智薰水催化剂二、酶类药物研究中涉及的研究项目和内容1、原料选择及反应研究。

16、2，酶或酶的选择研究。3，酶催化反应的最佳工艺条件研究。4、产品的分离纯化第五章植物细胞培养制药第一，植物细胞的生理特性，植物细胞培养基本过程和技术。生理特性：1、比微生物细胞大得多。2、群体生长特性，单细胞生长，难以繁殖；3、对剪切力敏感，抗拉强度大，剪切力小。4、生长速度慢，运行周期长；5、容易形成细胞群；6、大部分植物细胞的生长和二次代谢的生产需要一定的光照和时间，不同波长的光的效果不同。预设程序：1、外植体的获取和预处理；2、悬浮细胞株3、悬浮细胞株筛选4、植物细胞扩大培养；5、大规模培训基本技术：1、植物细胞获取技术；2、植物细胞育种和改良技术；3、植物细胞培养技术；4、植物细胞培养

17、二次代谢产品技术；5、植物细胞培养生物切换技术第二，植物细胞获得的主要方法和操作过程，植物细胞培养约束的培养方法。愈伤组织培养的基本过程和操作。主要方法：直接从外植体分离，获得愈伤组织柔道，原生质体再生操作过程：1、explants选择和预处理。选择时要考虑的因素包括外植体大小、同一植物不同部位的选择、不同种类的选择、植物的年龄、采访季节。请注意灭菌剂和灭菌时间的选择和灭菌后的无菌水洗。2、直接分离：(1)机械捣碎法：先将外植体轻轻捣碎，然后通过过滤和离心分离分离细胞。(2)酶解法：利用果胶酶、纤维素酶等分离具有代谢活性的细胞。3.愈伤组织诱导法：(1)诱导培养器的制备(2)在外植体移植诱导培养器中产生愈伤组织(3)愈伤组织继代培养(4