苏州大学本科生毕业论文 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-2的克隆、序列分析及表达及表达

1、目录摘要1前言31材料和方法41.1材料和主要试剂41.2方法41.2.1引物设计41.2.2 PCR扩增目的片段41.2.3目标市场区隔和回收(Takara回收试剂盒)51.2.4酶切反应51.2.5连接响应61.2.6易感细胞的制备61.2.7连接产物的切换61.2.8试剂盒提取质粒DNA61.2.9重组质粒识别和排序61.2.10原核表达71 . 2 . 11 SDS-page蛋白传记电泳82结果92.1野蚕Serpin-2基因的cDNA序列克隆92.2野生蚕Serpin-2基因的cDNA序列分析102.3 Serpin-2重组表达载体酶切鉴定142.4蛋白表达和SDS-PAGE分析15

2、2.5 Western Bloting分析153讨论16工具书：17谢谢18附录1.19附录2.20家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-2的克隆、序列分析、表达和表达摘要本研究以蚕的对照品种为材料，使用cDNA作为模板克隆人桑蚕蛋白酶抑制剂Serpin-2基因。利用大肠杆菌原核表达系统(BL21)进行家蚕Serpin-2基因表达研究。主要结果如下：根据已知野生蚕的Serpin-2(GenBank登录名：AF242200.1)序列，为了适当的引物设计，利用PCR方法克隆蚕的Serpin-2基因。序列分析表明蚕的Serpin-2基因编码区域长度为990bp，有329个氨基酸，相对分子量约43.

3、75 kDa，等电点约为4.67。据推测，与家蚕Serpin-2相比，发现、两个基因序列的相似性为99.29%，氨基酸序列相似性为98.93%，家蚕Serpin-2和野蚕Serpin-2基因的作用相同或相似。将大规模构建家蚕的Serpin-2基因复制到原核表达载体pET-28a()，转化为大肠杆菌BL21，通过1 mmol/L IPTG诱导蛋白质表达。SDS-PAGE传记游泳分析表明，诱导Serpin-2向IPTG柔道蚕转化的BL21菌与BL21菌、空pET-28a()切换BL21菌相比，出现特异性蛋白带，与分子量约44 kDa相比，家蚕Serpin-2的BL21菌与预计大小相比家蚕Serpi

4、n-2基因的成功克隆和原核表达研究为分析Serpin在分子水平上的野蚕功能奠定了基础。关键词：蚕；塞芬-2；基因克隆原核表达cloning and prokaryotic expression of serpin-2 gene of Bombyx moriAbstractIn this study，The gene of serpin in Bombyx mori(serpin-2)Was cloned by PCR using The whole body cdnas as templates . e . coli prokayaccording to the sequence of Bom

5、byx mandarina serpin-2 gene，Proper primer was designed and serpin-2 gene of Bombyx morithe serpin-2 gene was constructed to the prokaryotic expression vector pet-28a()和then transformed into e . coli BL21(des L iithe success ful cloning and prokaryotic expressing research of serpin-2 gene in Bombyx m

6、ori has established the foundation for analying the fuctionkey word : Bombyx mandarina；塞芬-2；克隆；Prokaryotic expression全言Serine protease inhibitor，Serpin(丝氨酸蛋白酶抑制剂)是从古代抑制剂进化了5亿年的结构序列的同系物蛋白质酶抑制剂，是一种球形蛋白质，各种Serpins约有30%的序列动员性，疏水区域动员性70% 目前约有500%由350 500个氨基酸3组成，具有非常保守的三阶段结构。抑制剂在真核生物、细菌、病毒等领域被陆续鉴定，并且经确认，超

7、家族成员也存在于病毒、植物、动物细胞组织中。其中大部分是从哺乳动物血浆中分离出来的，大部分与凝血过程有关4。丝氨酸蛋白酶抑制剂通过调节一系列丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸酶的活性，参与了很多基本的生命活动3，广泛用于农业、医药、食品等领域，对昆虫的生命活动也很重要。Serpin还富含昆虫的头、睾丸和卵巢。丝腺，中肠也有分布，受到外部微生物刺激时，Serpin在昆虫的血淋巴和脂肪体(Tong Y and Kanost MR，2005)中大量表达。Aratake H、et al、1990；Zou and Jiang，2005)。有报道说，有些Serpins在血细胞细胞质中表现出来，有些Serpins蛋白在

8、细胞内发挥作用，位于细胞质、细胞质和细胞核(Tong Y and Kanost MR，2005)上。风扇顺序，2003)。近10年来昆虫Serpin分子水平的研究进行得很快，但与哺乳动物相比，对新基因的发现、基因结构分析、表达调控和基因功能的研究较少，部分基因的功能机制还不清楚，鳞翅蚕的研究较少。目前对家蚕serpin家族成员的研究主要集中在Serpin6(柳俗里、河野香等)、Serpin16(东光、赵平等)、Serpin4(车洪县、河野香等)。牙齿中对Serpin2的研究主要由烟蛾、Tong和Kanost(2002)发现烟蛾serpin2A参与免疫反应，抑制烟草蛾Serpin2等多种血淋巴酶

9、。使用革兰氏阴性菌及阳性菌刺激烟草蛾后，Serpin2与血液中的HP1形成复合物。另外，Serpin2同时形成HP21和其他两个未确认的蛋白酶和复合物。Zou等(2009)进化分析蚕的34个serpin，发现蚕的Serpin2和烟蛾的Serpin2A具有很高的动员性。为此，牙齿课题计划对家蚕的Serpin2基因进行更详细的研究，主要集中在基因克隆、序列分析比较上。为研究家蚕Serpin2蛋白的功能奠定了基础。本研究计划利用基因库，通过野生蚕丝素蛋白酶抑制剂(Serpin2)基因序列，已知序列进行引物设计。利用PCR技术基因克隆技术扩增和克隆家蚕的Serpin2基因。经过基因测序，分析和比较序列

10、。达到研究目的。1.材料和方法1.1材料和主要试剂家蚕(对照)cDNA、宿主菌E. Colitg1菌种、BL21菌株均为苏州市大学特殊经济动物饲养实验室保存。克隆载体pUCm-T是Takara公司的产品。原核表达载体pET-28a()由本实验室保存。PCR试剂盒(包括Taq酶、dNTPmix、10buffer等)、凝胶回收试剂盒、250 BP DNA Marker、100bp-6000bp DNA Ladder Marker、限制性内切酶Hind3、小牛血清白蛋白是上海市生物工程有限公司产品。质粒少量快速提取试剂盒上海市新功能补菜生物技术有限公司产品。NCBI的Blast工具；ExPASy联机

11、ScanProsite节目(http:/www . ExPASy . org/tools/pi _ tool . html)；http:/www . CBS . dtu . dk/services/signalp联机节目；只有Dna软件；Tanon Gis凝胶图像处理系统。1.2方法1.2.1引物设计根据家蚕的Serpin-2序列，设计了一对引物扩增野生蚕Serpin-2基因的ORF区域。正向引物SPN 2f:5 -cccaagctcaattcgtccacg-3 反向引物SPN 2r:5 -cgcgatccatgattcaaggct-3 1.2.2 PCR扩增目的片段A.按照离心管中塔卡拉萨T

12、aq酶的使用指南，如下：DdH2O35.5 L10LA PCR缓冲II (Mg2 Plus)5 LDNTP混合物(每个10 mmol/L)4 LSerpin2F2 L (10 mol/L)Serpin2R2 L (10 mol/L)模板cDNA1 L(约0.1 0.2 g)LaTaq酶0.5 LTotal volumn:50LB.将含有上述混合物的反应管插入PCR装置。PCR反应体系的条件如下。94初步变性2分钟94变性30 sec48C复性30 sec 33 cycles72扩展1.5分钟72扩展10分钟C.PCR反应完成后，经5 L传记英东确认。1.2.3分离和回收目标市场细分(Takar

13、a回收试剂盒)(1)在传记永冻板上，切下含有目的DNA片段的凝胶块。(2)将橡胶放入1.5毫升管内，切成适当的小块，加速溶解。添加200 l橡胶块融化液DR-I缓冲。(3)均匀混合后75加热熔融胶块。这时，橡胶块必须间歇性地振动，以便完全融化。(4)将DR-II Buffer100 l(1/2 DR-I Buffer量)加入上述粘合剂熔体中，均匀搅拌。(5)将试剂盒中的Spin Column放置在收集池中。(6)将上述混合液丢弃为Spin Column，12，000r/min离心1分钟，过滤器。(5)将300 l线A放入Spin Column，12 000 r/min离心30s，废弃废液。(6)将500 l线B放入Spin Column，12 000 r/min离心30s，废弃废液。(7)重复步骤(6)。(8)将Spin Column放置在新的1.5ml离心管道上，在Spin Column膜的中心添加25ul灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温固定1min。(9) 12，000r/min离心1分钟洗脱DNA。1.2.4酶切反应DdH2O 8