课题3　分解纤维素的微生物的分离

1、目标:,1、知道纤维素酶的种类及作用,2、初步掌握从土壤中分离出分解纤维 素的微生物的实验方法,纤维素与纤维素酶,1.纤维素,纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。,一、基础知识,植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。,思考：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，但却不会在地球上大量的积累，为什么？,纤维素能被土壤中某些微生物分解 利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。,土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。,在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维

2、素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。,人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面料等。,草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？,2.纤维素酶 纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,取二支20mL的试管,实验：纤维素酶分解纤维素的实验,各加入一张滤纸条,各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和10ml,甲 乙,在乙试管中加入1mL纤维素酶,两支试管固定在锥形瓶中，放在 14

3、0r/min的摇床上振荡1h,结果：乙试管的滤纸条消失,讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？,提示： 本实验的自变量是纤维素酶的有无，自变量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pH。,实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？,（二）纤维素分解菌的筛选,1、筛选纤维素分解菌的方法是_。该方法可以通过_反应直接筛选。,刚果红染色法,颜色,2、其原理是：刚果红可以与纤维素形成_，当纤维素被_分解后，红色复合物无法形成，出现以_为中心的_，我们可以通过_来筛选纤维素分解菌。,红

4、色复合物,纤维素酶,纤维素分解菌,透明圈,是否产生透明圈,练一练：,1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是,A. 纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种 B. 纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖 C. 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁 D. 葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖,2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是,A. 刚果红能与纤维素形成红色复合物 B. 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C. 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物 D. 若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,挑选产生透明圈的菌落,实验设计

5、,思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？,本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。其他步骤基本一致。,分布环境,1、土壤取样：,富含纤维素的环境中,操作步骤,生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,原因,2、选择培养,增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。,目的：,制备选择培养基：,操作：,将土样加入装有30ml选择

6、培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。,培养基成分分析,阅读与思考,29页“资料二”相关问题。,问题一：是液体培养基，因为没有添加琼脂。,问题二：具有筛选作用，因为培养基中的碳源是纤维素，该培养基只有能分泌纤维素酶的纤维素分解菌才能生长。,问题三：选择培养基具有筛选、纯化微生物的作用。,按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101106倍。,3.梯度稀释,4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养 基上 制备培养基:参照课本旁栏中的比例配制。 倒平板操作。 涂布平板：将稀释度为104106的菌悬液各 取0.1ml

7、涂布到平板培养基上，30倒置培养。 挑选产生透明圈的菌落(参照课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落,即为分解纤维素的菌落.),鉴别纤维素分解菌的培养基,(水溶性羧甲基纤维素钠),方法一：先 ，再加入刚果红进行颜色反应。 方法二：在 时就加入刚果红。,培养微生物,倒平板,5.刚果红染色法,挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。,这两种方法各有哪些优点与不足？,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐 刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便不存在菌落混杂问题,1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈 2.有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,方法一中NaCl溶液的作用？,思考：,漂

8、洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。,在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C 370C培养，可获得纯化培养。,6、纯化培养,四、结果分析与评价,1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。 2.分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。,为了确定分离得到的是纤维素分解菌

9、，还需要进行_实验，纤维素酶的发酵方法有_ 发酵和_ 发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_ 含量进行定量测定。,发酵产纤维素酶,液体,固体,葡萄糖,五、课题延伸,将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上,将细菌培养在只有纤维素粉做碳源的选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,选择培养，增加浓度,在细菌分解尿素的化学反应 中，细菌合成的脲酶将尿素 分解成了氨，氨会使培养基 的碱性增强，pH升高。在培 养基中加入酚红指示剂，如 果pH升高指示剂会变红,刚果红可以与纤维素形成 红色复合物，当纤维素被 纤维素酶催化分解后红色 复合物无法形成，培养基 上就会出现以纤维素分

10、解 菌为中心的透明圈,观察菌落周围是否有红色的 环带出现来鉴定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现透 明圈来筛选纤维素分解菌,脲酶检测法,刚果红染色法,分解纤维素的微生物的分离,纤维素酶,种类、作用、催化活力,刚果红染色,筛选原理,实验设计,土壤取样,选择培养,涂布培养,鉴定培养,前置染色法 后置染色法,富含纤维素土壤,增大分解菌含量,染色鉴别,分离出分解菌,课堂总结,练一练,1、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物学观点？（ ） A、生物结构与功能相适应的观点 B、生物结构与功能整体性观点 C、生物与环境相适应的观点 D、生物发展进化的观点,2、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（ ） 土壤取样 梯度稀释 选择培养 菌悬液涂布平板 挑选出单个菌落 A、 B、 C、 D、,3、有关选择培养正确的叙述是（ ）,A、可以增加纤维素分解菌的浓度 B、可以减少纤维素分解菌的浓度 C、所用培养基是固体培养基 D、所用培养基是平板培养基,C,B,A,11年39.【生物 选修1：生物技术实践（15分） 有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。回答问题： 在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以 为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于 培养基。 纯化菌种时，为了得到单菌落，常