中国药科大学 生物化学 基地班 第四章 蛋白质化学.ppt

1、第四章 蛋白质化学、氨基酸、多肽及蛋白质类生物药物,1833年，Payen和Persoz分离出淀粉酶。 1864年，Hoppe-Seyler从血液分离出血红蛋白，并将其制成结晶。 19世纪末，Fischer证明蛋白质是由氨基酸组成的，并用氨基酸合成了多种短肽 。 1938年，德国化学家Gerardus J. Mulder引用“Protein” 一词来描述蛋白质。,1951年, Pauling采用X（射）线晶体衍射发现了蛋白质的二级结构-螺旋(-helix)。 1953年，Frederick Sanger完成胰岛素一级序列测定。 1962年，John Kendrew和Max Perutz确定了血

2、红蛋白的四级结构。,第一节 概论,一.蛋白质在生命活动中的重要性 (一）蛋白质是生物机体的结构物质 表41 人体各器官组织总蛋白质的含量（g/100g干组织）,(二）蛋白质是生物的功能物质,1. 生物催化作用 2. 代谢调节作用 3. 免疫保护作用 4. 物质的转运与贮存 5. 运动和支持作用 6. 生长、繁殖、遗传和变异作用 7. 生物膜的功能 8.接收和传递信息的作用 9.其他,三、蛋白质功能的多样性,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,催化代谢反应。这是蛋白质的一个最重要的生物学功能,调节蛋白参与基因表达的调控。它们激活或抑制遗传信息转录为RNA 激素参与代谢调

3、节,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,受体蛋白起接受和传递信息的作用。,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,某些蛋白质具有转运功能，携带各种小分子、离子等从一处到另一处。,有些蛋白质有贮藏氨基酸的作用，用作有机体生长发育的氮源。 如蛋类中的卵清蛋白为鸟类胚胎发育提供氮素 小麦种子中的醇溶蛋白为种子发芽提供氮素。,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,人和动物的运动，靠肌肉的收缩来实现，参与肌肉收

4、缩的主要成分是肌球和肌动蛋白，没有肌球蛋白和肌动蛋白，就没有人和动物的运动。,构建和维持生物体的结构，这类蛋白称为结构蛋白。 细胞的片层结构，如细胞膜、线粒体膜、叶绿体膜和内质网膜等都是由不溶性蛋白与脂类组成的。 在高等动物里，胶原蛋白参与结缔组织和骨骼的形成，作为身体的支架。 动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,有些蛋白质具有主动的防护功能，抵抗外界不利因素对生物体的干扰。 如脊椎动物体内的免疫球蛋白（抗体），能中和外来有害物质（抗原）。 抗冻蛋白：南极水域中某些鱼类血液中含有，保护血液不被冻凝。 蛇毒和蜂毒的溶血蛋白和神经毒蛋

5、白以及一些植物毒蛋白（蓖麻蛋白）等少量可引起高等动物产生强烈毒性反应。,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,应乐果甜蛋白有着极高的甜度，作甜味剂。 某些海洋生物如贝类，分泌一类胶质蛋白，能将贝壳牢固地粘在岩石或其他硬表面上,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,综上所述：蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,蛋白质有三种分类方法（一）根据分子的性状分类,二、蛋白质的分类,2.纤维状蛋白质 形如纤维，不溶于水，如指甲、羽毛中的角蛋白和蚕丝的丝蛋白等,1

6、.球状蛋白质 分子似球形，较易溶解，如组蛋白、 免疫球蛋白等,（二）根据组成分类 1. 单纯蛋白质：组分只有 氨基酸2. 结合蛋白质：由蛋白质和非蛋白质物质组成,（三）根据溶解度分类 1. 清蛋白类:能溶于水。如，血清蛋白，卵清蛋白等 2. 球蛋白类:微溶于水而溶于稀中性盐溶液。如，血清球蛋白、肌 球蛋白和大豆球蛋白等 3. 谷蛋白类:不溶于水、醇及中性盐溶液，但溶于稀酸、稀碱。如 米、麦蛋白 4. 醇溶谷蛋白类: 不溶于水、溶于7080乙醇。如玉米蛋白 5. 精蛋白类:溶于水及酸性溶液（呈碱性，因含Arg），含碱性氨基酸较多（如Arg,Lys,His）。如鲑精蛋白 6. 组蛋白: 溶于水及稀

7、酸，含Arg,Lys较多，呈碱性。如珠蛋白 7. 硬蛋白:不溶于水、盐、稀酸、稀碱溶液。如胶原蛋白、角蛋白及弹性蛋白等,1.元素组成：蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、钼、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50-55% 氢 6.5-7.3 氧 19-24 氮 16% 硫 0-3 其他 微 量,第二节 蛋白质的化学组成,蛋白质的含氮量,大多数蛋白质的含氮量接近于16%，这是蛋白质元素组成的一个特点，也是凯氏（Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量的计算基础。所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质

8、的大概含量： 样品中蛋白质含量=蛋白氮 6.25 6.25为蛋白质系数，即1克氮所代表的蛋白质量（克数）,二、蛋白质的组成单位：氨基酸,氨基酸（Amino Acid,简称AA）是构成蛋白质的基本单位，不管多么复杂的蛋白质，其水解的最终产物都是AA。 氨基酸是羧酸分子中碳原子上的一个氢原子被氨基替代而成的化合物，故称氨基酸,（一） 蛋白质水解,蛋白质和多肽的肽键可被催化水解 酸/碱能将蛋白完全水解 酶水解一般是部分水解,得到各种AA的混合物,得到多肽片段和AA的混合物,氨基酸是蛋白质的基本结构单元,蛋白质月示胨多肽肽AA 1*104 5*103 2*103 1000 200 100 -500,（

9、二） 氨基酸的结构,地球上天然形成的AA300种以上。 构成蛋白质的AA只有20余种，且都是-氨基酸。,（一）蛋白质的水解 常用的蛋白质的水解方法有 1.酸水解法： 优点：完全水解成AA 不会使AA发生旋光异构作用 缺点：营养价值较高的Trp完全破坏，含OH的AA也被部分 破坏 2.碱水解法： 优点：Trp不被破坏，水解液清亮 缺点：AA发生消旋，消旋后的D-AA人体不能用 3.酶水解法： 优点：条件温和（3750，常压），设备简单 不破坏AA,不产生消旋 缺点：水解时间长，天气热要防腐 水解不完全，中间产物多,什么是氨基酸？,（二）AA结构的共同特点 AA的结构通式 R代表侧链基团 1.酸性

10、的COOH 两性电解质,这一特点使不同的AA具有 碱性的NH2 某些共同的化学性质 2.除甘氨酸（Gly , R=H）外,其它的AA RH,它们的碳原子都 是不对称碳原子，也就是手性碳原子，因而具有光学活性，可 以形成D或L两种异构体。 目前已知的天然蛋白质中的AA均为L-型AA，且均是AA,故称 L-()AA,具,-C-C-C-C-COOH -C-C-C-C(NH2)-COOH -氨基酸 -C-C-C(NH2)-C-COOH -氨基酸 -C-C(NH2)-C-C-COOH -氨基酸,什么是-氨基酸？,(三)氨基酸的分类 组成人体蛋白质的基本AA有二十种，区别是侧链R基团不同。R基团的结构和性

11、质也作为AA分类的基础。根据R基团将AA分为： 1. 酸性氨基酸: 即R基团含羧基（酸性基团）。pH7时， 带负电。这类氨基酸有两个,2.碱性氨基酸: R基团含有碱性基团，在pH7时，这些基团 可质子化使分子带有正电荷。这类氨基酸有三个,3.中性氨基酸：在pH7时，基本不带电荷而显中性 的氨基酸，有15种。 根据R基团的极性又分为： 非极性或疏水性氨基酸 极性不解离氨基酸,非极性或疏水性氨基酸，有8种,极性不解离氨基酸：即R基团有极性但不解离，有7种,按基的化学结构分类：,、脂肪族aa,（）中性aa,（2）含羟基或硫aa,（）酸性aa及其酰胺,（）碱性aa,、芳香族aa,、杂环aa,（二）不常

12、见的蛋白质氨基酸,由常见aa经修饰而来。,（三）非蛋白质氨基酸,150多种 多是蛋白质中L型-AA衍生物 有一些是-，-，-AA 有些是D-型AA,鸟氨酸 瓜氨酸,4.特殊氨基酸 有一些AA仅存在于少数蛋白质中，例如：,二碘酪氨酸形成甲状腺素 另有一些AA虽然不存在于天然蛋白质中，而是游离于生物体内，但它们与蛋白质代谢有密切关系，如鸟氨酸、瓜氨酸等。,（四）必需氨基酸与蛋白质的营养价值,上述组成蛋白质的二十种氨基酸中，必需氨基酸有8种 Lys（赖） Trp(色) Val(缬) Phe（苯丙）Thr(苏) Leu(亮) Ile(异亮) Met(甲硫，蛋),1.必需氨基酸：机体需要但机体不能合成或

13、合成量少， 不能满足需要，而要有食物供给的AA。,2. 蛋白质的营养价值 生理价值：衡量食入蛋白质在生物机体内的利用率 食物中蛋白质在体内的利用率称为蛋白质的生理价值,氮的保留量：用于机体生长或修补细胞及组织所消耗的蛋白质的量 氮的吸收量食入量粪便排出量 氮总平衡（氮平衡） 机体摄入的氮量和机体排除的氮量相等 氮负平衡 食入氮量排出氮量,如处于生长发育、疾病恢复的机体,食物中蛋白质的营养价值取决于其AA组成。 食物中蛋白质在体内的利用率称为蛋白质的生理价值 世界粮农组织（FAO)确定和推荐的一个食物蛋白质中八种必需AA的比例： Ile Leu Lys Phe Met Thr Trp Val F

14、AO标准 4.2 4.2 4.2 2.8 2.2 2.8 1.4 4.2,蛋白质的互补作用 所谓蛋白质的互补作用就是指将必需AA缺乏或不足而又不相同的两种或几种蛋白适当配合于膳食中同时食用，以收到取长补短、互通有无的效果，使单独使用时无生理价值的具有一定的生理价值，生理价值低的有所提高。,蛋 白 质 的 生 理 价 值,混合蛋白质的生理价值,（五）氨基酸的重要理化性质,1.物理性质 无色结晶，各有特殊晶形，熔点高，在水中溶解度各不 相同，易溶于酸、碱，一般不溶于有机溶剂。,NASA Marshall Space Flight Center (NASA-MSFC),This is a colle

15、ction of protein and virus protein crystals that were grown on the US Space Shuttle or Russian Space Station Mir.,2.两性电离性质AA最重要的性质 等电点（PI）：在适当的酸碱度是，AA所带的正负电荷值相等 ，净电荷为零，这时AA所处的溶液的pH值就称该AA的等电点。因此：如果溶液的pHpI，则AA带负电。 如果溶液的pHpI，则AA带正电。,氨基酸具有特征性的滴定曲线,甘氨酸滴定曲线,含共轭双键的氨基酸具有紫外吸收性质,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280nm 附近。,大多数蛋白

16、质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,蛋白质的结构层次,一级结构,二级结构 超二级结构 结构域 三级结构 四级结构,高级结构 空间构象,第三节 蛋白质的结构、性质、结构与功能的关系,（一）、蛋白质分子的一级结构 定义：即蛋白质的化学结构。指的是蛋白质分子中多肽链AA种类、数量和排列顺序及它们之间连接键的性质。它是蛋白质作用的特异性、空间结构的差异性和生物学功能多样性的基础,一、蛋白质的结构,1.肽键与肽 由一个AA分子的COOH与另一分子AA的NH2脱水缩合而形成化合物的作用叫成肽作用，生成的化合物叫肽（

17、peptide），连接这两个AA间的化学键叫肽键 （peptide bond）。 注意：由N个AA组成的肽，就有N-1个肽键，称N肽。,2.多肽链的结构 多肽链中AA，由于参与肽键的形成，已非原来完整的分子故称为AA残基,多肽链中AA残基按一定顺序排列：氨基酸顺序 含游离-氨基的一端：氨基端或N-端 含游离-羧基的一端：羧基端或C-端 AA顺序是从N-端开始以C-端氨基酸残基为终点 如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,3.几种常见的多肽 谷胱甘肽：Glu-Lys-Gly（谷氨酰胱氨酰甘氨酸） 催产素 9肽 加压素 9肽 血管舒缓素 9肽 促肾上腺皮质激素（ACTH） 29肽,（

18、一）、肽和肽键的结构,肽键中C-N键有部分 双键性质 不能自由旋转 组成肽键原子处于 同一平面（肽平面） 键长及键角一定 大多数情况以反式 结构存在,共价主链,体内有许多激素属寡肽或多肽,4.肽与蛋白质的区别 Pr： MW6000(或10000)，有自己特征的三维结构。 多肽： MW6000(或10000)，不一定有三维结构，有时虽有但不稳定。,5.连接二条肽链之间的二硫键,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。,目 录,胰岛素空间结构,三、蛋白质一级结构的测定,什么是Pr的一级结构？,蛋白质中氨基酸的排列顺序。,1.

19、样品必需纯（97%以上） 2.知道蛋白质的分子量 3.知道蛋白质由几个亚基组成 4.测定蛋白质的AA组成并根据分子量 计算每种AA的个数 5.测定水解液中的氨量计算酰胺的含量,前提,（一）、蛋白质测序策略,(1) 测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,（一）、蛋白质测序策略,(2) 多肽链的拆分,蛋白质一级结构的测定,（一）、蛋白质测序策略,几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。 可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。,蛋

20、白质一级结构的测定,（一）、蛋白质测序策略,(3) 断开二硫键 在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，防止重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,（一）、蛋白质测序策略,蛋白质一级结构的测定,(4)测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比,（一）、蛋白质测序策略,(5)分析多肽链的N-末端和C-末端 (6)多肽链断裂成多个肽段 采用两/多种不同的断裂方法将多肽 断裂成两套或多套肽段，并将其分离。,蛋白质一级结构的测定,（一）、蛋白质测序策略,(7)测定每个肽段的氨基酸顺序,蛋白质一级结构的测定,(8)确定

21、肽段在多肽链中的次序 利用两/多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA顺序。,蛋白质一级结构的测定,蛋白质一级结构的测定包括蛋白质分子中氨基酸的组成和排列顺序的分析。 氨基酸组成的分析,（1）样品要求均一。 （2）根据末端分析以确定蛋白质分子中多肽链的数目。 （3）将纯化后的蛋白质样品水解，对其N末端和C末端进行测序,N末端氨基酸分析方法：,（1）二硝基氟苯法（DNFB） （2）二甲氨基奈磺酸氯法（DNS-Cl） 不能在同一肽链上重复应用，因为肽链在酸水解中已完全降解为氨基酸。 （3）Edman降解：该方法仅水解释放多肽链N末端残基，可以从N端逐一连续测定氨基酸序列。,C末端

22、氨基酸分析方法：,一般来说，C末端分析比N末端分析误差大。,（1）肼解法：多肽链与无水肼加热发出肼解，C末端氨基酸以自由形式释放，游离的C端氨基酸可用DNFB法或者DNS法鉴定。 （2）羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，能特异性地从C末端将氨基酸依次水解，是C端常用测序方法。目前发现的羧肽酶有A，B，C和Y四种，各自专一性不同。其中羧肽酶Y能切断所有氨基酸在C末端的肽键，是一种最适用的羧肽酶。,大分子多肽氨基酸顺序的确定,一般来说，对小分子肽可直接测定其氨基酸顺序，而对大分子肽尚难直接测定。目前常用方法先将大分子多肽裂解为小的肽段，分离纯化后，分别测定各肽段顺序。由于不同裂解方法产生肽段的不同

23、，可以从已测出氨基酸顺序的小肽中找到关键的“重复顺序”，从而确定各小肽段在整个肽链中的位置，从而推导出该大分子肽链的氨基酸顺序。,核酸推导法：,目前DNA测序技术已经相当成熟，如果能测出核酸序列，就可以根据核苷酸翻译出蛋白质序列。,(二)蛋白质分子的空间结构（高级结构） 1.构型与构象的概念： 构型：是指光学活性不对称的一种特定的立体结构，对于含某一不对称碳原子的分子而言，是该不对称碳原子上各取代基团或原子在空间的排列。 以Ala为例， Ala分子中有一个不对称碳原子C，因此Ala的构型就是指C上各基团或原子（COOH、NH2、H、CH3）在空间的排列（只能有两种），构型的改变一定要有共价键的

24、变化。,构象：又称三维结构，立体结构，空间结构或高级结构等。是指分子中各原子、各基团之间的相互立体关系。从理论上说，构象可以有无数种，因为一个构象的改变是由于单键的旋转而造成的不需有共价键的变化。,2、蛋白质分子内部的作用力,肽键、二硫键一级结构 氢键、疏水作用、范德华力、离子键、二硫键三维结构,维持蛋白质分子构象的作用力 a.盐键b.氢键c.疏水键d.范得华力e.二硫键,氢键( Hydrogen bond ),两负电性原子对氢原子的静电引力所形成 XHY 质子给予体X-H和质子接受体Y间相互作用 氢键具有： 方向性-（键角）指XH与HY间的夹角 饱和性- XH只与一个Y结合,2.蛋白质的二级

25、结构、三级结构和四级结构,蛋白质二级结构(secondary structure)是指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。,-螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ),蛋白质二级结构的主要形式：,维系二级结构的主要化学键： 氢键,1.肽单位（peptide unit） 肽键与相邻的两个碳原子所组成的基团， 称为肽单位或肽平面（peptide unit）,肽键是一个刚性的平面,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于

26、同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) ,也称肽键平面。,肽键中C-N键具有部分双键性质 组成酰胺的原子处于同一平面,多肽链：通过可旋转的C连接的酰胺平面链 这种旋转是受到限制的,（一）-螺旋 （-helix）,1、-螺旋的结构, 螺旋（ -helix）,蛋白质分子中多个肽键平面通过氨基酸a碳原子的旋转，使多肽链的主骨架沿中心轴盘曲成稳定的螺旋构象。,（1）螺旋方向为右手螺旋，每3.6个氨基酸旋转一周，螺距为5.4nm。肽键平面与螺旋长轴平行。 （2）氢键是螺旋稳定的主要次级键。相邻的螺旋之间形成链

27、内氢键。 （3）肽链中氨基酸残基的R基团侧链分布在螺旋的外侧，其形状，大小及电荷等均影响螺旋的形成和稳定性。,-螺旋是常见的蛋白质二级结构,由两/多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成。 肽链主链呈锯齿状折叠构象。,（二） -折叠,（ -pleated sheet）,折叠结构（ pleated sheet structure）,又称片层结构。折叠中多肽链的主链相对较伸展，多肽链的肽平面之间呈手风琴状折叠。此结构具有以下特征:,（1）肽链的伸展使肽平面之间一般折叠成锯齿状。 （2）两条以上肽链（或一条肽链的不同部分）平行排列，相邻肽链之间的肽键相互交替形成许多氢键。 （3）肽链

28、的平行走向有顺式和反式两种。N端在同侧为顺式，不同侧为反式，反式较顺式更加稳定。 （4）肽链中氨基酸残基的R测链分布在片层的上下。,-折叠使多肽链形成片层结构,平行式：所有肽链的N-端都在同一边 反平行式：相邻两条肽链的方向相反,2、-折叠的类型,-转角和无规卷曲在蛋白质分子中普遍存在,-转角,第一个氨基酸残基的羰基与第四个氨基酸残基之间形成氢键,比较稳定的环状结构,主要存在于球状蛋白分子中 多数处在蛋白质分子的表面,无规线团（random coil）,无规则卷曲,细胞色素C,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,纤维蛋白,不溶性纤维蛋白 （角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白）,可溶性纤

29、维蛋白 （肌球蛋白 血纤蛋白原）,硬蛋白,大纤维,鳞状细胞,皮层细胞,微纤维,微原纤维,初原纤维,螺旋,超二级结构,超二级结构又称模块（motif）是指在多肽链内顺序上相邻的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成有规律的二级结构聚集体。如：螺旋组合（）、折叠组合（）等。是介于二级结构和结构域之间的一个构象层次。超二级结构的形成，主要是组成它们的氨基酸残基测链基团相互作用的结果。,组合,结构域,结构域是位于超二级结构和三级结构之间的一个层次。结构域是蛋白质三级结构内独立的折叠单元，通常是由几个超二级结构单元组合而成。在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，进一步折叠

30、成一个或多个相对独立的致密三维实体，既结构域。,结构域与分子整体以共价键相连，一般难以分离，这是它与蛋白质亚基结构的区别。不同的结构域有各自独特的空间构象，并承担不同的生物学功能。如免疫球蛋白（IgG）由12个结构域组成。,免疫球蛋白的结构,立体结构模型,蛋白质的三级结构：是指多肽链在二级结构的基础上，由氨基 酸残基侧链的相互作用使多肽链进一步盘旋和折迭，导致整个 分子形成很不规则的特定构象。,溶菌酶的三级结构,1、全结构（反平行螺旋）蛋白质,2、，结构蛋白质,3、全结构（反平行折叠片）蛋白质,反平行桶,蛋白质的四级结构：蛋白质的每条肽链被称为一个（subunit）。 由两个或两个以上的亚基之

31、间相互作用，彼此以非共价键相联而形成更复杂的构象，称为蛋白质的四级结构。,血红蛋白四级结构,亚基也称亚单位，有人也称它为原聚体或单体。亚基一般由一条多肽链组成，也可由两条或两条以上的多肽链组成。亚基本身具有一、二、三级结构，由亚基相互作用构成具有四级结构的蛋白质称为寡聚肽。,尿酸氧化酶分子由四个亚基组成,超二级结构 supersecondary structure,结构域 Structure domain,二、蛋白质的结构与功能 各种蛋白质都有其特异的生物学特性,而这些功能都与蛋白质分子的特异结构密切相关。总的来说,蛋白质的功能取决于一级结构为基础的蛋白质的空间构象。 （一）、蛋白质一级结构与

32、功能的关系 1.一级结构不同,生物特性各异 例如 加压素 N CysH-Tyr-Phe-Glu-Asp-CysH-Pro-Arg-Gly 催产素 N CysH-Tyr-Ile-Glu-Asp-CysH-Pro-Leu-Gly 两者均为9肽，差异仅是第三与第八位两个AA，但生物功能却有 根本区别： 加压素：收缩血管，升高血压 催产素：引起子宫收缩，催产,2. 一级结构中的“关键”部分相同,其他部分可以不同,但功能相同。 所谓“关键部分”,我们也可以称之为”活性中心”。 活性中心:是指由几个氨基酸组成的一个空间区域。蛋白质的生物活性集中表现在这一空间区域,并与这一区域中的氨基酸组成, 排部等密切相

33、关。,尿酸氧化酶活性中心与尿酸, 氨基酸残基序号 胰岛素 A5 A6 A10 B30 人 Thr Ser Ile Thr 猪 Thr Ser Ile Ala 狗 Thr Ser Ile Ala 兔 Thr Gly Ile Ser 牛 Ala Gly Val Ala 羊 Ala Ser Val Ala 马 Thr Ser Ile Ala ,不同生物与人的Cytc的AA差异数目,黑猩猩0 恒河猴1 兔9 袋鼠10 牛、猪、羊、狗11 马12 鸡、火鸡13 响尾蛇14 海龟15 金枪鱼21 角饺23 小蝇25 蛾31 小麦35 粗早链孢霉43 酵母44,黑猩猩0 恒河猴1 兔9 袋鼠10 牛、猪、羊

34、、狗11 马12 鸡、火鸡13 响尾蛇14 海龟15 金枪鱼21 角饺23 小蝇25 蛾31 小麦35 粗早链孢霉43 酵母44,与人不同的AA数目,生物,3.一级结构中的”关键”部分(活性中心)的变化,使生物活性也改变或者丧失,甚至造成遗传性疾病。 如 镰刀型贫血，这是一种遗传性疾病，患者的红细胞呈镰刀状，易溶血，严重影响与O2结合的运输功能，究其原因是因为患者血红蛋白与正常人的相比发生了变化。,HbA 链 H2N缬组亮苏脯谷谷赖 HbS 链 H2N缬组亮苏脯缬谷赖,（二）、蛋白质空间结构(构象)与功能的关系 1.酶原的激活 体内多数酶以无活性的酶原的形式存在.当机体需要时再转变成有活性的酶

35、,这称为酶原的激活。激活过程本质上时通过除去部分肽链片段,引起空间结构的变化而形成特定的空间构象,生成或暴露催化作用所必需的”活性中心”，这样的酶才表现为生物活性。 2.蛋白质前体的活化 许多蛋白质（如蛋白质激素）在体内往往以前体的形式贮存，它们无活性或活性很低。如胰岛素在体内和合成的前体称胰岛素原，由84个AA残基组成（胰岛素是由51个AA残基组成），其活性仅为胰岛素的10。在体内，胰岛素原经专一性酶的作用，切掉多余的AA，最终表现为完整的生物活性 3。蛋白质的变构现象,（三）、蛋白质的结构与生物进化,研究不同来源的蛋白质结构上的差异，不仅可以了解蛋白质结构与功能的关系也是研究生物进化的重要

36、新方法。 以细胞色素C为例，脊髓动物细胞色素C由104个AA残基组成，比较不同来源的细胞色素C的一级结构，发现其中有35个AA残基恒定不变，而其它可变的部分队细胞色素的构象和功能的影响不是决定性的，但确能显示出种属之间的差异性，凡与人类亲缘关系愈远，其结构差异愈大。,三、蛋白质的性质 （一）、胶体性质 布朗运动 光散射现象 不能透过半透膜 有吸附能力 因此，蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体。稳定的原因主要有： 蛋白质表面有水化层 蛋白质颗粒表面带有许多NH3+、COO-、CO、-NH2、OH、-SH等亲水极性基团，它们易与水起水合作用，从而在蛋白质颗粒表面形成较厚的水化层，使蛋白质颗粒相互

37、隔开，阻止其聚集沉淀。 蛋白质表面具有同性电荷 由于AA具有两性解离和等电点，而蛋白质是由AA组成，故蛋白质也是两性物质 pHpI 蛋白质的等电点（pI）概念：在某一pH值时，它们所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，这一pH值称为蛋白质的等电点。,（二）蛋白质的两性解离和等电点 （三）蛋白质的变性 定义：某些物理或化学因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，导致其生物活性丧失和一些理化性质的改变，这种过程称为蛋白质的变性作用。,1. 蛋白质变性作用的本质：是蛋白质分子空间构象的改变和破坏，而一级结构不变，此外，少数蛋白的变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。,2.

38、 变性作用的特征 生物活性的丧失： 蛋白质变性的主要特征 某些理化性质的改变：如溶解度降低，结晶性丧失，粘度增加 等电点有所提高 生化性质改变 3. 变性作用的意义 对需要保留生物活性的蛋白，（如酶、激素等生物药物），则 应在提取分离过程中尽量避免使其变性失活。 有时要充分利用蛋白的变性作用，除去不需要的蛋白。,(四)蛋白质的免疫学性质 1.抗原和抗体的基本概念,能诱导机体形成抗体的大分子外来异物称为抗原（或免疫原） 抗原或免疫原的性质：a.异原性 b.大分子性 c.特异性 抗原的特异性决定于抗原分子表面的特殊化学基团，称为抗原决定簇。 抗体：动物针对外来物质的出现而合成的一种蛋白质，它是由相

39、应抗原刺激机体免疫系统所产生的免疫球蛋白。抗体具有特异性，它仅能与相应的抗原发生反应，抗体的特异性是由于它在化学结构上具有与抗原决定簇相对应的抗原片断，使二者可以特异性的相结合。 抗体经电泳分析：它主要存在于区，故称为球蛋白（或丙种球蛋白），又因抗体具有免疫学性质，又称免疫球蛋白，简写Ig，共有五大类：IgG IgA IgM IgD IgE,2.单克隆抗体 动物体受抗原刺激后，B淋巴细胞可产生抗体。含遗传基因不同的B淋巴细胞具有合成不同抗体的潜能，当机体收抗原刺激时，抗原分子上许多决定簇分别刺激各个具有不同基因的B细胞，被激活的B细胞分裂增殖形成多克隆（繁殖），并合成多种抗体。,如果能选出一个

40、制造一种专一性抗体的细胞进行培养，比如， 选 进行培养，则 不断分裂（克隆），得到一个细胞群，这个 细胞群在遗传性质上是相同的就称为单克隆（细胞），单克隆细胞 只合成一种抗原决定簇的抗体，这种抗体就称为单克隆抗体。 单克隆抗体与普通抗体相比所具备的优点： 特异性强，效价高 单克隆抗体的产量很大,单克隆抗体的制备 第一步：将抗原注射到小鼠体内进行免疫，取出受免脾细胞，与小 鼠骨髓瘤细胞融合。 第二步：用选择培养基，选出杂交瘤细胞，逐一克隆或扩增，从中 选出能产生抗体的杂交瘤细胞。 第三步：将杂交瘤细胞接种在培养瓶中扩大培养或注射到动物的体 液中作为腹水瘤生长，然后再分离纯化单克隆抗体。 单克隆抗

41、体的意义 单克隆抗体与疾病诊断 生物导弹,（五）蛋白质的沉淀反应 蛋白质分子聚集而从溶液中析出的现象，称为蛋白质的沉淀。 蛋白质的沉淀方法 1.中性盐沉淀 中性盐：NaCl, (NH4)2SO4等 低浓度盐溶（低盐浓度使蛋白质表面吸附某种离子，使其颗粒同性电荷 增加而相互排斥加强，并与水分子作用增加，从而提高溶解度） 高浓度盐析（破坏水化层中和电荷） 2.有机溶剂沉淀 有机溶剂（乙醇、丙酮、甲醇等），使蛋白质表面失去水化层，相互凝聚而 沉淀。 3.加热沉淀 加热可使蛋白质变性沉淀，而肌肉沉淀又与溶液的pH有关，在等电点时最易 沉淀，而偏酸或偏碱时，蛋白质虽加热变性也不易沉淀。 4.其它的沉淀反

42、应：如重金属沉淀，生物碱试剂的沉淀反应,（六）蛋白质的颜色反应,2.双缩脲反应：蛋白质在碱性溶液中与Cu离子 产生红紫色复合物，此反应称为双缩脲反应,1.茚三酮反应：蛋白质与茚三酮溶液加热可产生蓝紫色，此反应可用于蛋白质的定性与定量,3.酚试剂反应：在碱性条件下，蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸可与酚试剂反应，生成蓝色物质，蓝色的强度与蛋白质的量成正比。,第四节 蛋白质类分离、纯化 与鉴定的基本原理 一、蛋白质的提取 1.选材：新鲜，来源易得，所需蛋白质含量高。 2.破碎组织和细胞： 动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器，或用超 声波破碎法。 植物组织和细胞，一般需要加石英砂和适当的提取 3.选择

43、适当地介质（一般用缓冲液）把所需要的蛋白提取 出来。,二、蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化主要依据蛋白质以下的几个性质1. 根据蛋白质所带电荷的差异2. 根据蛋白质的溶解性不同3. 根据蛋白质分子大小4. 根据蛋白质生物学性质的不同（一）根据蛋白质所带电荷的差异 不同的蛋白质，pI不同： pHpI 带负电 pHpI 带正电 pHpI 净电荷为零,1.电泳 带电颗粒在电场中向其所带电荷相反的电极移动的现象称电泳 蛋白质颗粒在电场中移动的速度（泳动的速度）与蛋白质所带电荷量和分子量有关：分子量大，带电荷少，移动慢；分子量小，带电荷多，移动快 在某一pH溶液中，不同的蛋白质，等电点不同，所带电荷

44、不同，因此在电场中移动的速度不同。一定时间后，移去电源，不同的蛋白质就停留在各自的位置上。生化分离中需要的支撑物质有醋酸纤维薄膜,聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖凝胶等。 2.离子交换层析法 离子交换树脂是一种不溶于水、有机溶剂 和酸、碱的高分子物质，由骨架和骨架上的 交换基团组成。 根据交换基团的不同，可把树脂分为： 阳离子树脂：交换基团是阴离子（SO3,COO,Cl等),可与阳离子结合 阴离子树脂：交换基团是阳离子（N+(CH3)3, Na+,H+等）,可与阴离子结合 作用原理：蛋白质是两性物质，在一定pH下，不同的蛋白质带不同的电荷， 可与树脂上的交换基团结合，而与其它蛋白质分离，然后用更强的 离

45、子强度将其洗下,（二）、根据蛋白质的溶解性不同的分离纯化方法 1. 等电点沉淀 利用蛋白质在等电点时溶解度最小的原理，通过控制（调节）溶液的pH，沉淀 不同的蛋白质，从而达到分离的效果。 2. 盐析法 中性盐类（A+B）对蛋白质的溶解度有双重影响： 低浓度的中性盐能增加蛋白质的水合作用，故能增加蛋白质的溶解度，称盐溶作用。 高浓度的中性盐：由于A+B均是带电荷的离子，它逐渐中和蛋白质表面所带的电荷，且夺走了蛋白质表面的水分子（因为大量的中性盐必需与水结合才能溶解），从而破坏了水膜，因此蛋白质沉淀，称盐析作用。 由于不同的蛋白质的分子量、等电点、离子半径不同，在一定pH下所带电荷也不同，因此利用

46、不同浓度的中性盐可以沉淀不同的蛋白质。 3. 低温有机溶剂沉淀法 当蛋白质溶液加入与水互溶地有机溶剂时，有机溶剂有以下的作用： 争夺蛋白质表面的水膜（脱水） 改变蛋白质原来环境的介电常数，加大蛋白质分子中带不同电荷极性基团 之间的相互吸引，促进蛋白质分子的聚集和沉淀。,(三)根据蛋白质分子大小不同来分离纯化 1.透析和超滤 透析：利用蛋白质不能通过半透膜的性质将其与其它小分子物质分离（如盐、 小分子糖、小肽） 超滤：利用压力或离心力，强行使水和其它小分子物质通过特定材料制成的半 透膜，而使蛋白质留在膜上。 2.凝胶过滤，也称分子筛、分子排阻层析等 原理：用交联剂将凝胶类（如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖、葡聚糖）聚合成一种具有三维空间的网状结构物质，根据交联剂量的不同，具有不同的孔径。将其装入层析柱内，让所需分离的混合物通过柱（如下图），可实现分离纯化。 3.密度梯度离心 当蛋白质在具有密度梯度的介质中离心时，蛋白颗粒的沉降速度取决于其分子大小和密度：质量大，密度大，沉降快； 质量小，密度小，沉降慢 当每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等地介质梯度时，就停留在此，可分离得到。,（四）利用蛋白质的生物性质来分离蛋白质亲和层析 亲和层析是利用蛋白质所具有的生物学特异性质上的差别，如抗原和抗体、酶与底物、激素与受体等它们之间存在有特殊的一种亲和力，将这些能特异性相互作用的两种物质