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银杏叶提取物对百草枯诱导PC12细胞凋亡的保护作康小刚，陈建中，徐峥，李海龙，王柏仁a.中医研究中心，老年性脑病中西医结合医学实验室，西京医院，中国公关b.全军神经生物学研究所，第四军医大学，西安，陕西710032，中国公关2006年3月17日收到，2007年2月14号接受，2007年2月21日可在线摘要以往的研究表明，银杏叶提取物（EGb761）对凋亡的神经元细胞或者通过MPTP诱导的神经元样细胞有潜在的保护作用。在这项研究中，已经测试过银杏叶提取物对百草枯（PQ伤害过的PC12细胞的影响，PQ是一种神经毒素。结果表明，孵育后，经过以银杏叶提取物对PC12细胞一起培养之前PQ的曝光，百草枯诱导的细胞存活率下降得到显着回升，线粒体膜电位（MMP）的减弱及细胞凋亡百分率均减少。此外，银杏叶提取物预处理使酪氨酸羟化酶的人数（TH）的正面和bcl- 2阳性细胞明显增加，经过与PQ处理过的细胞单独相比，经过PQ诱导过的PC细胞中的caspase- 3阳性细胞数显著退化。这项研究表明，银杏叶提取物对百草枯具诱导PC12细胞凋亡的保护作用。银杏叶提取物对百草枯- PC12细胞损伤的保护作用的基本机制可能与bcl -2的激活，增加维修基质金属蛋白酶的稳定性，并通过减少线粒体依赖性途径中caspase-3的活化有关。这一研究结果，为银杏叶提取物对帕金森病的治疗的潜在用途提供了一实验依据。2007爱思唯尔有限公司保留所有权利。关键词：帕金森氏病;百草枯;银杏叶提取物，细胞凋亡，PC12细胞，神经保护作用简介银杏叶是一种广泛使用的草药。标准化银杏叶提取物的称为EGB761，标准化的银杏叶提取物含有24的黄酮醇苷，萜，6（银杏内酯，白果内酯），7原花色素及其他成分（德Feudis，1991）。已经证明银杏叶提取物能有效保护神经元在不同的实验方式中引起的损害。因此，银杏叶已被提议作为一个治疗帕金森病（PD）的潜在试剂（克里森治疗，2001年）。研究表明，在MPTP诱导之前或之后银杏叶提取物均能有效地保护。防止1-甲基-4苯基吡啶离子诱导PC12细胞的凋亡（MPP系统+）。但是，尚未有任何有关报告银杏叶提取物对神经诱导剂百草枯（1,10-二甲基- 4,40-联吡啶，百草枯，PQ）的，一种广泛使用的非选择性除草剂也有类似的结构的MPP+产生影响。（清水等。，2001）电能质量，已证实有造成氧化的压力，导致对人类和动物有毒性，产生帕金森病症状（厚泽等人。，1990）。PQ和MPP+之间的结构相似性表明其作为一个潜在的可能产生帕金森病的致病因子。以往的研究表明，帕金森病的发病率和PQ曝光的等级之间有很强的相关性（刘等人，1996年。刘等，1997;。Morano等，1994）。利用动物模型的研究还表明，百草枯毒性作用可诱导黑质纹状体多巴胺能神经细胞（Thiruchelvam等。，2003）。PC12细胞，一个从大鼠肾上腺嗜铬细胞建立的细胞系（Greene和Tischler，1976），拥有多巴胺（DA）的细胞内合成的基板，以及代谢和运输（灿，1981;。Rebois等，1980年Tuler等，1989）。这些细胞含有的酶能够满足多巴胺的合成和分解的要求，如酪氨酸羟化酶（TH）和单胺氧化酶。PC12细胞中合成的膜受体与递质与位于中脑的多巴胺能神经元相似。因此，PC12细胞系统已作为帕金森病的研究的细胞模型（提摩太和威廉细胞模型，1991年）。在完成调查研究，通过PQ在PC12细胞中的情况，以测试银杏叶提取物对神经毒性可能产生的影响，以提供银杏叶提取物对帕金森病诊疗的潜在用途的实验依据。2。材料和方法3。结果 3.1。银杏叶提取物对百草枯诱导的细胞存活率下降 在与不同浓度的PQ经24小时（50-600 lmol/ L）的培养，采用MTT法对PC12细胞的细胞存活率测定。与对照组相比，降低了电能质量浓度依赖性（图1a）的细胞活力。在300 lmol/ PQ的L时，细胞存活率达53.35.1。当PC12细胞分别用300个不同时间lmol/ L的电能质量，细胞死亡增加的曝光时间（图1b）延长，达到24小时57 5.4，如图所示。 1C号，银杏叶提取物显着保护PQ对PC12细胞的毒性作用。银杏叶提取物对细胞活性的增加与浓度和时间相关，人们发现，细胞毒作用是由preincubations减毒10，20和40 lg/ml在PC12 细胞中。分别与对照组相比，EGb761/ mL的银杏叶提取物提高细胞存活率65.84.6，71.65.6and82.4 6.2。3.2。银杏叶提取物对百草枯引起的LDH释放为了进一步探讨银杏叶提取物的保护作用，设计LDH释放实验，LDH释放是细胞毒性的另一个指标，这个实验已经完成.实验的结果与MTT法测定的相似。 300 lmol/ L处理电能质量导致LDH释放在中期（236 8.8）（图1D）条的增加。孵育10，20和40 lg/ mL的银杏叶提取物，分别阻挡PC12细胞LDH释放系统的18910.3，168 135 9.8和8.6。3.3。银杏叶提取物对百草枯诱导的凋亡率增加PC12细胞染色既PI和FITC标记的膜联蛋白V（视听- FITC标记），以流式细胞仪分析细胞凋亡与细胞百分比。对坏死细胞由AV/ PI双+染色，自当失去了完整的PI膜进入细胞，并与核酸结合进行了论证。凋亡细胞被证明由AV+/ PI双染色，因为AV结合磷脂细胞凋亡过程中易位到细胞膜外层。AV+/ PI双染细胞+有可能迟到或坏死细胞凋亡和AV/ PI的细胞的存活细胞为代表。在对照组中，大部分细胞是可行的（92.9）（图2a）。当PC12细胞暴露于300 lmol/ L的PQ中，AV+细胞数显着增加（41.6）（图2b）。同时孵化（10，20和40 lg/ml）银杏叶提取物和PQ显着减少了与AV标记细胞的数量。细胞凋亡的比例显着下降，分别为33.8，25.7和19.4。（图2c-e）3.4。银杏叶提取物对百草枯诱导的基质金属蛋白酶破坏MMP在百草枯诱导PC12细胞和银杏叶提取物孵育结果是由罗丹明123，罗丹明123是一个特定的荧光染料，阳离子活性线粒体是容易被保留汇总评估的。和对照组相比，在PQ的治疗后，罗丹明123荧光在PC12细胞降低。银杏叶提取物预处理（10，20和40lg/毫升）依赖性地剂量可以逆转MMP减少造成的电能质量（图3a）。3.5。银杏叶提取物对百草枯诱导的DNA片段在细胞凋亡过程中，DNA片段引起内切酶的激活。核染色的强烈外观为支离破碎的DNA从细胞核凋亡产生30- OH的结束终端的标记。TUNEL阳性细胞的定量分析如图3B所示。PC12细胞暴露于300 lmol/ L的电能质量显着增加TUNEL阳性细胞计数总额的比率（20.51.02），而对照组为（5.60.93）。10，20和40 LG电子/ mL的银杏叶提取物预处理降低了TUNEL阳性细胞的比例，分别为19.40.73，13.70.95，和9.10.64。3.6。银杏叶提取物对TH和caspase- 3和bcl- 2表达的PQ的处理PC12细胞为了阐明与银杏叶提取物对PQ诱导的保护作用相关的可能的分子机制，免疫细胞化学染色TH和caspase- 3和bcl- 2进行。与对照组细胞的免疫染色表明，量词的TH阳性和bcl- 2阳性细胞和明显的caspase - 3的阳性细胞增加造成重大损失，观察电能质量，培养细胞。与此相反，只与百草枯相比，10，20和40 lg/ mL的银杏叶提取物预孵育显示，随着TH显着增加，与bcl- 2阳性细胞和比较，caspase - 3的阳性细胞减少。4。讨论近几年的研究聚焦在PQ的曝光和神经退行性疾病的关系。已经发现，PQ选择性杀伤实验动物的多巴胺神经元（Corasaniti等，1992;。Corasoniti等，1998;。麦科马克等，2002）或导致体外培养的多巴胺能神经元中脑损伤（惠子等人。，2003）。细胞凋亡被认为在百草枯引起的神经系统疾病的神经元丢失了中发挥了重要作用。然而，PQ的神经毒性的机制仍然不清楚。有研究表明百草枯诱导细胞凋亡是由氧化应激（Cappelletti等介导的，1998年;。Fabisiak等，1998;。McCarthya等，2004;。Mollace等。，2003）。目前的研究结果表明，电能质量在50-600 lmol/ L的诱导剂量影响PC12细胞凋亡。对PC12细胞暴露于300 lmol/ L的PQ的24小时显着降低细胞存活率用MTT法检测，增加培养液中乳酸脱氢酶的释放，产生细胞核染色质的浓缩，分散，导致MMP的破坏，结果导致bcl 2降低和caspase - 3活性增加。Bcl - 2的是在线粒体膜，核膜和内质网（布雷德森，1995年）的蛋白。它会阻止基质金属蛋白酶的各种刺激的去极化的诱导，抑制cytochromeric和其他蛋白酶从线粒体的释放，然后抑制caspase - 3的激活（克克等，1997;。清水等人，1995年;。杨等人，1997年）。中央细胞凋亡通路组件是caspase家族的蛋白酶。 Caspase - 3的是通过几种不同的途径引发了多种类型的哺乳动物细胞凋亡的强大效应，半胱氨酸蛋白酶在细胞色素的C -依赖的细胞凋亡途径（斯特拉瑟等。，2000）是一个最重要的。caspase - 3的活化似乎是细胞凋亡的关键。我们的研究结果显示，PQ的抑制Bcl - 2的激活，这可能加快基质金属蛋白酶的去极化和caspase -3的活化，从而导致对PC12细胞凋亡。银杏叶提取物的神经保护作用已经在研究中通过体外和体内模型得到证实。鉴定出银杏提取物具有抗氧化性和自由基清除活性，从而通过调节抗凋亡机制和抑制淀粉样b聚合给任何蜂窝系统提供保护（史密斯和罗，2004）。也被报导说银杏提取物降低了所有青年鼠和老年鼠在大脑区域内相关基因bcl-2/bax的比例（路等，2006），保护了在培养视网膜神经细胞的培养中谷氨酸的毒性（王等，2005），降低了在6-羟多巴胺，损毁大鼠的行为损失（金等人，2004），并防止顺铂引起的周围神经病包括一些功能和形态恶化（Ozturk等，2004）。在体外，银杏叶提取物保护星形孢菌素诱导的神经细胞死亡和抑制蛋白酶在培养皮层神经元的活动（Massieu等，2004），对保护的培养神经元死亡所致的过氧化氢（Guidetti等，2001），谷氨酸（朱等，1997），一氧化氮（Bastianetto等。2000A型，b）和MPTP的（杨等。2001年a，b）项。截至目前，已经没有关于银杏叶提取物对百草枯诱导的神经毒性的保护作用的可用数据。在这项研究中，PC12细胞与银杏叶提取物孵育2 h，然后再暴露24小时电能质量。结果表明：在电能质量管理之前，用银杏叶提取物预处理显着提高细胞活