pcr反应扩增DNA片段-3.23.ppt

1、要用聚合酶链反应扩增脱氧核糖核酸片段，我们应该了解目的。1.了解聚合酶链反应技术的基本操作。2.了解聚合酶链反应的原理。3.探讨聚合酶链反应技术的应用。聚合酶链反应是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异性强、灵敏度高、产率高、快速、简便、重复性好、易于自动化等突出优点。它可以在试管中把目标基因或某个DNA片段扩增到10万甚至上百万倍，这样肉眼就可以直接观察和判断；足够的脱氧核糖核酸可以从一根头发、一滴血甚至一个细胞中扩增出来，用于分析、研究和鉴定。聚合酶链反应技术是生物医学领域的革命性创举和里程碑。(1)聚合酶链式反应原理，1)聚合酶的特性，它不能从头开始合成，只能从DNA的3个

2、末端延伸DNA链，所以DNA复制需要引物，2)DNA聚合酶的作用过程，当引物和DNA母链通过碱基互补配对结合时，DNA聚合酶可以从引物的3个末端延伸DNA链，DNA的合成方向总是从亚链的5个末端延伸到3个末端。3.根据聚合酶链反应原理，在80-100的温度范围内，脱氧核糖核酸的双螺旋结构会分解，双链会分离。这个过程叫做变性。当温度缓慢下降时，两条分离的脱氧核糖核酸链将重组为双链。聚合酶链反应利用脱氧核糖核酸的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚和结合。实质上，现在使用的聚合酶链反应仪也是一种能够自动调节和控制温度的仪器。高温解决了双链断裂的问题，但也导致了脱氧核糖核酸聚合酶的失活。耐高温T

3、aq DNA聚合酶解决了高温引起的DNA聚合酶失活问题，促进了聚合酶链反应技术的自动化。4.Taq DNA聚合酶的应用；5.缓冲液需要提供用于聚合酶链反应的物质、脱氧核糖核酸模板、两种引物、四种脱氧核苷酸和耐热脱氧核糖核酸聚合酶分别与两条模板链结合，同时通过控制温度在体外重复进行脱氧核糖核酸复制。6.细胞内和细胞外的DNA复制环境不同，聚合酶链反应过程中所需的引物不是核糖核酸，而是一条合成的DNA单链，其长度通常为2030个脱氧核苷酸。7.细胞内复制和聚合酶链反应的区别在聚合酶链反应过程中，脱氧核糖核酸的解链不依赖于解旋酶，而是通过控制反应温度来实现的。(2)聚合酶链反应的反应过程，1)聚合酶

4、链反应的反应步骤，聚合酶链反应一般要经过30多个循环，每个循环可分为三个基本步骤：变性、复性和延伸、变性(模板脱氧核糖核酸的解链)和将模板脱氧核糖核酸加热到90以上.经过一段时间后，模板DNA的双链DNA或通过聚合酶链反应扩增形成的双链DNA被解离成单链，从而可以与引物结合；2.在循环过程中，复性(退火)，将模板DNA加热变性为单链后，温度降至500左右，引物与模板DNA单链互补序列配对延伸，模板DNA引物偶联物在TaqDNA聚合酶作用下以脱氧核苷酸为原料。根据互补碱基配对和半保守复制的原理，以母链为模板合成了一条新的DNA链，经过3或30个循环后，靶序列的数目得到了扩增。4.作为聚合酶链反应

5、循环的结果，脱氧核糖核酸聚合酶只能在两个引物之间特异性复制脱氧核糖核酸序列，这使得这种固定长度的序列呈指数级扩增。从第二个循环开始，最后一个循环的产物也作为模板参与反应。引物延伸形成的DNA单链将与引物结合延伸DNA；2.聚合酶链反应实验操作，1。聚合酶链反应仪，(1)设备和器具，本质上是一种能够自动调节温度的仪器；2.微量离心管，薄壁塑料管，总体积为0.5毫升；3.微量移液管，用于定量转移聚合酶链反应配方中的液体，用于一次性移液管头上。移液枪头，1。准备，2。移液，(2)实验操作步骤：按照聚合酶链反应体系的配方将所需试剂放在实验台上，按照聚合酶链反应体系的配方将各种试剂加入带微量吸管的微量离

6、心管中。反应系统(25L):过程：盖紧微量离心喷嘴盖，用手指轻轻敲击管壁，注意：3。混合目的是将反应溶液混合均匀。a、离心机喷嘴的盖子必须盖紧，以防实验中脱落或液体溢出。将离心管放在聚合酶链反应仪上，设置聚合酶链反应仪的循环程序。过程：将微型离心管放在离心机上，离心约10s，4秒，4，离心，5，反应，离心目的：将反应液浓缩在离心管底部，提高反应效果，且聚合酶链反应技术灵敏度高。为了避免外源基因污染等因素造成的干扰，在聚合酶链反应操作中应注意以下几个方面。应采取预防措施隔离操作区域，所用的微型离心管、枪头、缓冲溶液和蒸馏水在使用时必须高压灭菌；2)分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头，(1)计

7、算理论DNA扩增数，(3)评估项目结果，(1)复制一段DNA n次，2段DNA 2n次，2段DNA a次，复制n次，DNA a2n次，(2)测量实验中DNA含量，(1)通过计算DNA含量评估扩增效果。脱氧核糖核酸在260纳米的紫外波段有一个强吸收峰，其大小与脱氧核糖核酸的含量有关。2.过程：稀释2微升的聚合酶链反应溶液，加入98微升的蒸馏水，即稀释样品50倍，将质控品调至零，用蒸馏水作为空白对照，将紫外分光光度计在260纳米波长下的读数调至零，将100微升的DNA稀释液加入比色皿。测量260纳米处的光吸收值，计算，计算，DNA含量(克)为50(260纳米处读数)稀释倍数，50: 1克/毫升DNA在1cm厚的比色皿中的吸收值为0.02，紫外分光光度计，比色皿，5。实验总结，聚合酶链反应仪在高温下加热使()变性，在低温下复性使引物和模板脱氧核糖核酸()重复改变反应温度这样，()三个阶段是一个循环，每个循环