基因工程技术

1、基因工程学，杰克逊，Symons，和博格(1972 )第一代组合dnamoleculescohenandboyer (1973年) producedfirstplasmidvectorcapableofbeingreplicatedwithinabacterialhostvectorscarriersofforeigndna，thenobelprizeinchemistry定义重组DNA技术(recombinant DNA technique ) :在各种酶的作用下，将细胞外的核酸片段(目的基因)在体外与病毒、细菌或其他载体在入口处切断，如此有目的的应用分子克隆技术，人为地改造基因， 改变生物

2、遗传性状的一系列过程统称为基因工程，是目的基因与载体DNA结合而成的DNA重组体在受体细胞内复制、扩增的技术。 基因表达(gene expression ) :指研究目的基因在受体细胞内的表达和功能。 应用：克隆感兴趣的基因进行序列分析，研究其组织结构。 转化至原核表达载体，进行大规模蛋白质合成，生产多肽产品。 转移到真核表达载体，导入细胞，研究其功能、表达调控机制等，基因工程基本步骤：基因工程流程图，重组分子(链接)，原料：目标基因：研究对象载体：目标基因载体酶：链接酶，限制酶， 目的基因片段的其他表达或克隆构建或从商品化的cDNA文库扩增) RT-PCR法得到目的基因cDNA人工合成基因片

3、段(价格高)，目的基因源的选择：决定解决什么问题。 基因功能的研究、cDNA、RT-PCR、基因表达调控的研究、基因组DNA、PCR、PCR :引入适当的酶切点、1个/2个。 加入保护碱，13个。 标记标志、Myc、His、HA等所需的标签。 密码子的开始和结束。 高保真度聚合酶： HF、Pfu、Probest等。 片断的回收与纯化、载体：载体(Vector )是目的基因的载体，它将目的基因带入受体细胞，起到使目的基因扩增和表达的作用。 种类：由来别：质粒载体(plasmid vector )、噬菌体载体(phage vector )、cosmid vector )、病毒载体(virus ve

4、ctor ) .作用别：克隆穿梭载体(shuttor ) 一般分子量低，复制数高，有松弛型复制子。 主要由细菌质粒或其质粒、噬菌体和真核生物病毒的DNA重组构建(PBR322 )。 表达载体(expression vector )是使目标基因在宿主细胞中表达的载体。 将重组体DNA导入适当的受体细胞，使负载的目标基因能够进行复制、转录、翻译(pCDNA3)。 穿梭载体(shuttIe vector )是两种可在不同生物体内复制和交流的载体，可同时拥有细菌质粒的复制原点和可识别真核生物的复制原点或酵母菌的自主复制序列(ARS )，可在原核细胞中扩增，在真核细胞中复制和表达。 主要用于原核细胞与真

5、核细胞之间进行基因转移。 质粒载体具有复制起点，这是质粒自我增殖的必要条件。 分子量小，拷贝数高，是松弛型质粒。 有选择性标记区分转化细胞和非转化细胞。 多为抗生素耐药基因，对受体细胞中的抗生素具有耐药性，便于转化体的选择。 (Ampr； Tetr )具有一些限制性内切酶的单一识别部位，便于外源基因的插入。 是能在细菌染色体外自我复制的双链环状DNA分子。 克隆载体： PBR322，特点：分子量小，4.3kb，操作方便。 有2个耐药基因，易于筛选转化体。常用限制酶的单一部位分布在抵抗性基因上，四环素选择标记上有7种，Amp抵抗性基因上有4种。 外来基因的插入破坏了抗性基因的完整性，使抗性基因的

6、插入失活，该特性可以用于区分重组和非重组分子。 松弛性颗粒在大肠菌细胞内具有高拷贝数，即使细菌蛋白质合成停止也可以继续复制。 原核His-tag: pQE系列，pet22(novagen)gst-taad，pCDNA3系列，真核表达载体：穿梭矢量pFLAG-CMV系列(Sigma )、Tet-on/tet-offexpressionsystems、Tet-off、ptet-splice (ptet-on/Tet-offexpressionsystems )载体为自环化用碱性磷酸酶(可以去除DNA-5末端p基，使5末端具有OH )处理载体，可以防止载体的自环化。 (b )目的基因和载体用产生粘末

7、端的2种限制酶切断连接，可以控制目的基因的插入方向(取向克隆)。 碱性磷酸酶处理：平头末端：(1)增加脂肪酶的量(脂肪酶对平末端DNA的Km约为粘性末端DNA的100倍，(2)在末端加人工脂肪酶位点，含有一定的限制酶位点，经酶切处理产生粘性末端，然后与载体连接。 人工接头中含有GAATTC序列，用EcoRI酶切，产生EcoRI粘性末端。 均聚物尾：载体和片段没有共同的粘性末端时，可以直接通过末端转移酶分别连接poly(dA )和poly(dT )，然后退火，直接转化，分子间断部分在宿主体内修复。 同尾酶(xho I； Sal I )，其他方法：Bgl II AGATCT TCTAGA，bamh

8、 IgG ATCC cc tagg (2) eco ri- Sali- -取向，载体本身不环化，四环素失活(3)XbaI-SalI-反向四环素灭活(4)目的基因片段： Bgl II -SalI，载体： BamH I -SalI反向，不能表达。 四环素失活(5) Not I-修平SalI一个粘性末端、一个平端SmaI-修平-SalI正向连接、四环素失活PstI？ SacI？连接浓度：片段与载体的连接概率自环化一般修正公式：粘性末端：载体片段含量(ng)/载体长度(kb) 1 DNA片段含量(ng)/DNA片段长度(kb) 3-5平末端1:5-。 DNA的纯度、载体和目的基因的比例ph值为ph7.

9、27.8是适当的。 14(16以下)一夜，结合酶：二种，DNA结合酶：在双链中的两个DNA链之间形成磷酸二酯键，封闭双螺旋骨架的缺口。 一条DNA链的3个末端具有游离的OH，需要另一条DNA链的5个末端的磷酸基p，需要能量吸收反应，存在ATP。 也可以修复DNA。 但是，不能连接2条单链DNA分子和环化的单链DNA分子。 而且只能连接粘性末端。 T4DNA连接酶：从感染T4噬菌体的Ecoli中分离得到的连接酶。 在粘性末端、平末端、平末端安装手动接头。 用途比DNA连接酶广泛，是分子生物学研究和基因克隆中常用的连接酶。 其他酶：末端修饰酶，末端脱氧核苷酸转移酶(terminaldeoxynuc

10、leotidyltransferase )简称末端转移酶。 在合适的反应体系中，该酶在DNA片段的平端的3oh中加入同型核苷酸，生成具有poly(A )、poly(T )、poly(G )或poly(C )的粘性末端。由于碱性磷酸酶需要重组DNA，为了防止两个DNA片段末端之间的连接，多采用碱性磷酸酶处理，使DNA末端的5p为5oh。 目前采用的碱性磷酸酶有大肠杆菌来源的细菌碱性磷酸酶(BAP )和小牛肠来源的小牛肠碱性磷酸酶(CIP )两种。 CIP的比活性比BAP高10倍以上，而且对热敏感，加热容易失活。 重组子导入受体细胞：将重组DNA导入受体细胞进行扩增，根据使用的载体特性选择合适的受

11、体细胞(原核、真核)，选择合适的转化和转染方法。 受体细胞要求：必须具有复制外源DNA的能力(为复制提供必要的原料)，如果不能表达导入的重组分子所提供的某些表型特征，有助于转化体细胞的选择和鉴定。 重组子导入受体细胞：途径、转化：质粒DNA或以其为载体构建的重组子导入细菌(受容性菌)的过程转染：噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子被动或被动地导入细胞感染：以病毒为载体的重组子，在体外被包装成具有传播力的病毒粒子，感染受体细胞，并与受体细胞基因组整合。 转化、受体细胞：大肠杆菌、基因工程中最常用的宿主细胞转化机制：细菌细胞的生物学特性随吸收外源DNA而遗传变化。 转化效率：质粒DNA转化时，约1

12、000个DNA分子中，只有一个DNA分子能成功的细胞比例很小。 一般来说，微克完整的pBR322DNA产生105-107转化细胞，调制受态菌，受态：细菌细胞处于容易吸收外来DNA的状态，这种状态的细菌称为受态菌。 氯化钙法：氯化镁法：氯化钙法：原理、快速生长的细菌用低渗透低浓度(50 100mM )的氯化钙(CaCl2)处理，使细胞膨胀成球形并加入质粒后，抗DNAase的羟基-磷酸钙根据、重组子的筛选：重组体的表型筛选，抵抗性基因插入失活：生存还是毁灭，互补现象：蓝白斑筛选，LacZ-受体菌编码半乳糖苷酶羧基端(c端)片段，载体编码半乳糖苷酶氨基互补现象：蓝白斑筛选，4290s 6000rpm

13、 5min，冰浴30min，6000rpm 5min，沉淀0.1mlCaCl2，10ul连接物，6ulPBR322，阴性对照，A T，A T，阳性对照，Amp， tee 94 10 min 30 s 40 s1min 72 8min4hold，X 30，碱分解法，碱分解法，原理： pH在12.0-12.5的范围内，线状DNA和环状质粒DNA发生变性，中间的氢键短裂，线状经过变性处理由于环状分子本身合为一体，因此复原性快且正确。 线性DNA在改性时相互分离，恢复性慢，不准确，相互聚集形成大的网状结构，离心分离后，与改性蛋白质和RNA一起沉淀，上清液中残留的主要是环状DNA分子和少量可溶性蛋白质和部分RNA，这些可溶性蛋白质和部分RNA用酚提取在RNA酶