课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、专题2 微生物的培养与应用,课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素CO(NH2)2是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,尿素分子的立体结构,分解尿素的细菌:,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,1、实例：,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。,原因：因为热泉温度70800C，淘汰了绝大多 数微生物只有Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,一、筛选菌株,2、实验室中微

2、生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,选择培养基：,在微生物学中，允许_，同时_生长的培养基。,特定种类的微生物生长,抑制或阻止其他种类微生物,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？,碳源：葡萄糖、尿素,氮源：尿素,思考： 从物理性质看此培养基属于哪类？ 从功能上属于哪类培养基？,固体培养基,选择培养基,此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,原则上能。培养基

3、的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,思考：怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为 唯一氮源 的培养基,牛肉膏 蛋白胨 培养基,是,分离 尿素 细菌,判断该 培养基 有无选 择性,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基 方法： 抑制大多数微生物生长 造成有利于该菌生长的环境， 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。,（

4、1）将土壤中的固氮菌分离出来,（2）将土壤中自养微生物分离出来,举一反三,（3）筛选出抗青霉素的微生物,（4）筛选出耐高浓度食盐的微生物,不加氮源的无氮培养基,不加含碳有机物的无碳培养基,加入青霉素的培养基,加入高浓度食盐的培养基,1 显微镜直接计数：,利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,缺点: 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,(二)统计菌落数目,2.间接计数法（活菌计数法） 原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先

5、的一个单细胞。1个菌落1个活菌 常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,相关计算,某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得 平板上菌落数的平均数为234，那么每克样 品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液 的体积为0.1ml） ( ) A. 2.34108 B. 2.34109 C. 234 D. 23.4,B,选择菌落数在30300的平板上计数。 需培养计算出三个或三个以上的平板菌落求平均数。 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,注意事项,看课本P22，并讨论你认为这

6、两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,第一位同学：没有重复实验（至少涂布3个平板） 第二位同学：A组结果误差过大，不应用于计算平均值,(三)设置对照实验,阅读P2223页“（三）设置对照”一段讨论教材中提出的问题。,设置对照的目的：,排除实验组中非测试因素对试验结果的影响，提高实验结果的可信度。,（1）A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。 一是由于土样不同； 二是由于培养基污染或操作失误（或者是混入了其他的含氮物质）。,究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。,(2)设置对照实验，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,结果预测

7、：如果结果与A同学一致，则证明_；如果结果不同，则证明A同学存在_ _,A无误,操作失误,或培养基的配制有问题。,小结：这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,实验流程：,样品稀释涂布平板,微生物的培养与观察,菌落计数,土壤取样,制备培养基,实验设计,从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,土壤“微生物的天然培养基”,土壤中的微生物数量最大、种类最多,大约70%90%是细菌,取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在 使用

8、前都要灭菌。,（一）土壤取样,制备选择培养基（尿素为唯一氮源） 制备牛肉膏蛋白胨培养基 相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,（对照作用）,思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？,（二）制备培养基,稀释倍数为 101 106。每个稀释度均用3个选择培养基和1个蛋白胨培养基。,（三）样品稀释涂布平板,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,分离不同的微生物采用不同的稀释度,原因：不同微生物在土壤中含量不同,（四）取样涂布,在菌落计数时，每隔24h

9、统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,（五）微生物的培养与观察,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。,微生物的培养与观察,菌落,菌落,一无菌操作 1、取土

10、用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好标记 注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。 三制定计划,三、操作提示,1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？,对照的培养皿无菌落说明培养基没有污染。 牛肉膏培养基的菌落数目多余选择培养基的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,四、结果分析与评价,2.获得某一稀释度下，菌落数30300的平板，在这以稀释度下,是否至少有两个平板的菌落数相接近？,相接近，说明操作成功。,四、结果分析与评价,1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高