第九章核酸的分离与提纯.ppt

1、第九章核酸的制备，第一节核酸制备的基本原理，核酸的类型脱氧核糖核酸：细胞核，单链或双链核糖体核糖核酸(核糖核酸)运输核糖核酸信使核糖核酸，细胞质，单链或双链，但任何核酸通常以核蛋白的形式存在于生物体中。因此，为了提取和制备核酸，有必要解偶联核蛋白(即，通过使用接头将核蛋白分成核酸和蛋白质)并除去蛋白质。同时，有必要保持核酸的天然特性而不使核酸变性或降解。为了减少各种不利因素对核酸的损害，需要快速彻底地去除蛋白质。为了保证分离的核酸的完整性和纯度，在实验过程中应注意以下条件和要求：(1)避免核酸被化学因素降解，如酸或碱等化学因素破坏多核苷酸链的磷酸二酯键而降解核酸；核酸(尤其是核糖核酸)在碱性溶

2、液中容易降解，因此提取介质的酸碱度通常为5.5-9.0。(2)通过物理因素减少核酸的降解物理因素主要是机械剪切力，包括强烈的振动、搅拌、细胞突然置于低渗透性溶液中以及溶液快速通过狭窄的通道；其次，冷冻和解冻、高温煮沸和辐射都会导致核酸的降解。机械剪切力主要破坏大分子量的线性脱氧核糖核酸分子，但破坏小分子量的环状质粒脱氧核糖核酸和核糖核酸分子相对较小。(3)为了防止核酸的生物降解，细胞内外的各种核酸酶可以作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构并将其降解；脱氧核糖核酸酶需要Mg 2和Ca 2的活化，因此在实验中经常加入乙二胺四乙酸和柠檬酸盐来复合核酸酶作用所必需的Mg 2离子，以抑制脱氧核糖核酸

3、酶的活性。由于RNase不仅分布广泛，容易污染，而且耐高温，即使被加热到蛋白质变性，Rnase的活性也不会完全丧失，而且它具有惊人的弹性，细胞中的核蛋白总是与它联系在一起。如果不完全清除，它将部分恢复活力，导致核糖核酸降解。生物降解是核糖核酸提取过程中的主要危害，储存的核糖核酸产品也不例外。因此，为了抑制核酸酶的活性，通常在低温(4或0，甚至-20)下进行。最好使用新鲜的生物组织或细胞样品进行核酸分离。如果提取不能立即进行，材料应储存在液氮或-80冰箱中。分离纯化核酸的一般原则是保证核酸一级结构的完整性，这是研究核酸结构和功能的最基本要求；二是消除蛋白质、脂类、糖类等物质的污染。纯化样品不应含

4、有对酶有抑制作用的有机溶剂或浓度过高的金属离子。蛋白质、脂类和糖类的污染应减少到最低程度；没有来自其他核酸的污染，例如，当提取脱氧核糖核酸时，应该去除核糖核酸。2。载体脱氧核糖核酸分离载体脱氧核糖核酸感染或转染细胞(病毒型)，转化细菌细胞(质粒型)，分离病毒颗粒，培养转化细胞，收集细菌，分离和纯化病毒载体脱氧核糖核酸，分离和纯化破碎的细胞。通过脱氧核糖核酸限制凝胶电泳回收特定的脱氧核糖核酸片段4。质量评价1)凝胶电泳2)光密度的测定3)限制性酶分析、第2节核酸制备的基本方法、核酸制备的步骤，(1)提取的组织或细胞的破碎和切除。要提取核酸，生物材料必须预先破碎或消融，这与核酸的回收率有关。为了破

5、碎和消融组织细胞，通常有使用均质器和捣碎器的机械方法、温和的重复冷冻和解冻方法以及使用表面活性剂或各种酶的处理方法。(2)提取核酸，除去与核酸结合的蛋白质、多糖和脂质，除去1.细胞破碎：一般来说，动物组织的细胞膜很脆弱，容易破碎，而植物和微生物的细胞则相对坚硬。细胞分裂的方法有很多，可以根据组织特征和核酸分离的目的进行选择。1物理方法，(1)对动物组织(如小鼠肝、兔肝等)进行机械粉碎。)，通常使用均质化。也就是说，将组织切成小块，放入研钵中，磨碎。为了提高研磨效果，可以加入一定量的石英砂。然而，应注意石英砂对有效成分的吸附。动物细胞也可以通过匀浆器处理来破碎。该方法温和，适合实验室应用。如果需

6、要大规模生产，可以使用电研磨方法，也可以使用酵母和植物组织的细胞破碎。(2)组织捣碎器法是一种暴力粉碎细胞的方法。用捣碎器(8 000-10 000转/分钟)处理3045秒后，植物和动物的细胞可以完全破碎。如果用它来破碎酵母和细菌的细胞，石英砂需要有效。在糖化过程中必须保持低温，以防止温度上升引起的活性成分变性，糖化时间不宜过长。超声波法是利用声波的振动力破坏细胞壁和细胞器的有效方法。由于细菌外面有一层细胞壁，很难将细胞壁打破，所以用超声波处理细菌和酵母需要更长的时间。有些细菌需要50分钟或更长的时间来破碎，如果在细胞漂浮液中加入石英砂，时间可以缩短。为了防止电器长期运行产生过多的热量，经常采

7、用间歇处理和降温的方法。(4)挤压是一种温和彻底的细胞破碎方法。也就是说，数十毫升的细胞悬浮液被高压迫使通过一个比细胞直径小的小孔，导致细胞被挤压压碎。2溶胀和自溶，(1)溶胀，概念：在低渗透溶液中，如低浓度的稀盐溶液，由于渗透压差，大量的溶剂分子会进入细胞，导致细胞膜膨胀和破裂，这就是所谓的溶胀。步骤：将细胞低温冷冻一段时间，然后取出至室温(或约40)快速融化。反复冷冻和解冻后，细胞会膨胀和破裂，同时形成冰颗粒，增加细胞液中的盐浓度。自溶，概念：细胞结构在各种水解酶的作用下溶解的现象称为自溶。注意：使用这种方法时要小心，因为水解酶不仅能破坏细胞壁和细胞膜，还能在自溶过程中分解一些活性成分。化

8、学处理：用脂溶性溶剂(如丙酮、氯仿、甲苯等)处理细胞。)或表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)，细胞壁和细胞膜的结构部分会被溶解，导致整个细胞被破坏。4生物酶降解，具有降解细菌细胞壁的功能。当用这种方法处理细菌细胞时，首先细胞壁熔化，然后细胞膜由于渗透压差而破裂，最后细胞完全破裂。2.核酸提取的基本方法：1 .去污剂(SDS)法，SDS(十二烷基硫酸钠)，是一种有效的细胞脱溶剂、核酸酶抑制剂和蛋白质变性剂，也是一种去污剂。洗涤剂法是由马尔穆尔在1961年创立的，最初用于从细菌中提取脱氧核糖核酸。原理：提取核酸时，利用SDS的非极性基团破坏蛋白质分子的二级键，使蛋白质变性，达到解偶联、变性和去除核蛋白

9、中蛋白质的目的。变性蛋白质保留在溶液中，不沉淀。为了同时分离溶液中存在的核酸和蛋白质，可以在室温下加入1/2体积的饱和硫酸铵沉淀蛋白质。特点：该方法产率高，对核酸影响小，但产品中残留微量蛋白质。SDS在低温或二价金属离子或钾离子存在下会形成沉淀，使用时应注意。苯酚也是一种蛋白质表面变性剂。在水溶液中，球状蛋白的亲水性氨基酸残基和疏水性氨基酸残基的侧链位于外侧和内侧。酚甲基苯酚的作用机制是：它可以插入到蛋白质结构中，破坏各种氨基酸残基侧链之间的二级键，使蛋白质结构颠倒，即原来存在于内部的疏水性氨基酸残基侧链向外翻，而在外部的亲水性氨基酸残基侧链向内翻，导致蛋白质变性。苯酚也能使核酸酶失活。3CT

10、AB法，CTAB(乙基三胺溴化物):是十六烷基三乙基溴化铵，是一种洗涤剂。特点：该方法相对简单，特别适用于植物材料，已成功地从一系列单子叶和双子叶植物中提取出总脱氧核糖核酸。用这种方法提取植物DNA时，可以用氯仿/异戊醇反复提取除去蛋白质，用高盐缓冲液选择性沉淀除去多糖杂质。机理：它能溶解细胞膜，与核酸形成复合物，可溶于高盐溶液(0.7摩尔/升氯化钠)，但当溶液的盐浓度降低到一定程度(0.3摩尔/升氯化钠)时，它会从溶液中沉淀出来，然后将复合物沉淀溶解在高盐溶液中，再加入乙醇沉淀核酸。由于十六烷基三甲基溴化铵溶于乙醇，离心后可得到脱氧核糖核酸沉淀。适用于新鲜植物和脱水物料，能很好地去除多糖杂质

11、，可优先用于含糖量较高的植物物料。另一个优点是在提取的早期阶段可以同时获得高含量的脱氧核糖核酸和核糖核酸。如果在随后的实验中两者都需要，它们可以单独纯化。加入核糖核酸酶去除核糖核酸；如果只需要脱氧核糖核酸；如果只需要核糖核酸，加入脱氧核糖核酸酶去除脱氧核糖核酸。虽然用这种方法制备的脱氧核糖核酸纯度不高，但仍能满足限制性内切酶分析、聚合酶链反应和脱氧核糖核酸重组克隆的要求。4、浓盐法，机理：高浓度的盐会破坏核酸和蛋白质之间的二级键，使核蛋白解偶联。一般用1摩尔/升氯化钠或4摩尔/升氯化钠提取，加入氯仿/异戊醇离心除去蛋白质，最后用甲醇或异丙醇沉淀核酸。氯仿可以使蛋白质表面变性，有助于脱蛋白。异戊

12、醇可以消泡以保持离心层的稳定性。特点：该方法对核酸的损伤较小，但由于蛋白质去除不完全，常与其他方法结合使用。5高通量核糖核酸分离技术，(1)微量吸管法，一种由Karrwer等人于1995年建立的方法。特点：该方法通过毛细管或微量吸管直接提取细胞内容物，并提取核糖核酸。在操作过程中，毛细管石英管被1号移液管拔出器拉入孔径为l0um的微量移液管中，并且微量移液管的尖端被弯曲23以穿透细胞壁。微量吸管安装在与空气泵连接的显微操作器上，约1微升的核糖核酸提取物(100毫升/升三盐酸，pH8.0；500毫升/升氯化锂；10摩尔/升乙二胺四乙酸；1% SDS；5摩尔/升差热分析)压入微量移液管。将含有提取

13、液的微量吸管下降到叶子表面，在275千帕的气压作用下，微量吸管顶端的一小滴提取液被排出。一旦微量吸管的尖端被排空，立即提供1.3千帕的负压，然后将微量吸管插入目标细胞。一旦插入，细胞内容物被吸入微量吸管。可以清楚地看到，细胞立即崩溃了。然后，将微量吸管离开细胞，将内含物注入10u1的核糖核酸提取物中，并重复使用69千帕和1.3千帕的正负压力将微量吸管的尖端冲洗干净。该方法可以直接从叶片的表皮细胞、防御细胞和叶肉细胞中提取基因，但不会损伤叶片。然后，加入含有50微克磁珠的10u1核糖核酸提取物，与寡核苷酸(dT-)连接，混合均匀，在22放置10分钟。然后，加入1倍的反转录缓冲液(50毫升/升盐酸

14、，pH8.3；75摩尔/升KCl；3摩尔/升氯化镁；10毫摩尔/升差热分析)洗涤两次以洗脱与磁珠结合的基因。(2)1激光捕获显微切割(LCM)，将冷冻或石蜡包埋的组织切成薄片，然后用激光切割所需的部分，然后通过静电作用被粘膜快速吸附，并立即转移到核糖核酸提取物中。优点：减少了对组织的处理，避免了核糖核酸表达谱的改变；由于时间在一些实验中非常重要，特别是在时钟基因的研究中，这种方法可以减少采样时间对实验的影响。(3)原生质体分离技术是一种从分生组织细胞中快速、准确提取核糖核酸的技术，已应用于制作拟南芥根的全局基因表达图谱。原理：首先，我们需要将荧光蛋白基因转移到受体细胞中，通过酶处理破壁，使那些

15、表达绿色荧光蛋白的细胞通过紫外线照射产生荧光，然后用荧光激活细胞分选仪(简称FACS)将它们从特定的组织或区域中分离出来，然后制备核糖核酸；第三，核酸的浓缩和沉淀。核酸的浓缩，如果溶液中的脱氧核糖核酸含量低且体积大，常用的核酸浓缩方法是真空干燥。该方法温和，特别适用于少量样品的浓缩。此外，还有以下两种方法：(1)丁醇提取和浓缩法，正丁醇或仲丁醇能吸收大量的水，而脱氧核糖核酸不溶于丁醇。根据这一特点，在DNA溶液中反复加入等体积的正丁醇或仲丁醇，摇匀，离心，去除有机相，可以显著减少DNA溶液的体积，浓缩DNA。(2)聚乙二醇，聚乙二醇通过水沉淀法也具有吸水能力。将脱氧核糖核酸溶液装入透析袋并包埋

16、在聚乙二醇中(分子量为6 00012 000)。聚乙二醇吸收水分并液化，同时减少了脱氧核糖核酸溶液的体积，因此可以通过更换聚乙二醇干粉来达到浓度。核酸沉淀是浓缩核酸最常用的方法。其最大的优点是核酸溶液的浓度可以通过沉淀来改变和重新调节，溶液中的一些盐和杂质可以被去除，从而在一定程度上纯化核酸。核酸是一种含有多种阴离子和阳离子的水溶性化合物，它与钠、钾和镁的盐在各种有机溶剂中不会溶解或变性。常用的有机溶剂有乙醇、异丙醇、聚乙二醇等。(1)通常用于沉淀核酸的盐及其浓度；1)NaAc:最常用于沉淀DNA和RNA的盐，最终浓度为0.3摩尔/升(ph 5.0)。2)氯化钠：含十二烷基硫酸钠的脱氧核糖核酸

17、样品的首选试剂，最终浓度为0.2摩尔/升.3) NHAc:四种脱氧核糖核酸均在NHAc溶液中具有较高的溶解度，大部分脱氧核糖核酸可通过乙醇沉淀去除。4)氟化钾：沉淀效果与氟化钠相同。最终浓度为0.3摩尔/升.然而，核酸的钾盐很难溶解在含有SDS的溶液中。如果在下一步中使用含有SDS的缓冲溶液来溶解核酸沉淀，则不应使用该方法来沉淀核酸。5)氯化锂：在乙醇中有良好的溶解性，在70乙醇中不能与脱氧核糖核酸共沉淀，在0.8摩尔/升的高浓度下可以直接沉淀大分子核糖核酸(包括核糖核酸和核糖核酸)，因此经常用于核糖核酸沉淀。氯化镁：Mg2是核酸沉淀的有效离子。当核酸浓度小于0.1微克/毫升或长度小于100个核苷酸时，加入10毫摩尔/升Mg2能明显提高核酸沉淀的回收率。Mg2不需要低