ch17植物基因转化受体系统.ppt

1、第17章 植物基因转化受体系统,植物基因转化受体的类型及其特性,植物基因转化受体的条件,植物基因转化受体系统的建立,受体系统常见的问题及其解决途径,植物基因转化的受体系统：一般是指通过组织培养途径或其它非组织培养途径，能够高效、稳定地再生无性系，并能接受外源基因的整合，对用于转化选择的抗生素敏感的再生系统 附：植物转基因技术的主要方法,第一节 植物基因转化受体的条件,高效稳定的再生能力 具有较高的再生频率 具有良好的实验稳定性和重复性 较高的遗传稳定性 植物受体系统接受外源基因后不影响自身非改造遗传体系 又能将外源基因遗传给后代，保持其遗传的稳定性 同时选材时注意尽量减小受体系统体细胞变异的发

2、生,具有稳定的外植体来源 由于基因转化频率低，实验重复较多，因此需要稳定的外植体来源 常用转化外植体：种子，无菌实生苗的胚轴、子叶或幼叶，一些植物的试管苗，以及可较高频率诱导的营养变态器官,抗生素敏感性 为了便于转化子的筛选需要使用选择标记基因（如抗生素抗性基因等） 选择性抗生素需满足的条件：植物受体材料对所选用的抗生素具有一定的敏感性；抗生素对受体植物没有剧烈的毒性，不会很快杀死植物细胞 对抗生素过度敏感或过度钝化的植物材料都不适合于构建植物转基因的受体系统,农杆菌敏感性 农杆菌介导的基因转化由于具有转化效率高、多为单拷贝插入等优点，是常用的植物基因转化方法 使用农杆菌介导的转化方法，需要植

3、物受体对农杆菌敏感 在选择农杆菌转化系统前，必须测试受体系统对农杆菌的敏感性,根瘤农杆菌 及其诱导产生的冠瘿瘤,由于众多类型的植物离体培养技术的完善，使转基因受体系统有了很大的选择范围 不同的受体类型具有不同的特点，适合的转化方法也不同 实际操作中应根据受体的特性，基因转化方法，选择适宜的受体系统,第二节 植物基因转化受体的类型及其特性,经过愈伤组织的受体系统是指外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并通过分化培养获得再生植株的受体系统 包括 外植体先诱导形成愈伤组织，再利用愈伤组织转化外源基因，进而再生植株 利用农杆菌直接侵染外植体，经过培养形成愈伤组织，再分化成植株,经过愈伤组织的受体系统,特点

4、 外植体来源广泛 扩繁量大，可获得较多的转化植株 适用的植物范围广 从愈伤组织分化的不定芽的多细胞起源特点，形成嵌合体较多 再生植物无性系变异较大，转化的外源基因遗传稳定性较差,注意问题 直接使用外植体组织进行农杆菌侵染时，应注意从活跃生长的植物部位取材 用愈伤组织进行转化，应在愈伤组织细胞处于分生细胞状态时进行转化，此时易于接受外源基因，转化效率高 愈伤组织必须保持良好的生长状态，继代周期不能太长,不经过愈伤组织的受体系统也称为直接分化再生系统，是指外植体细胞越过脱分化阶段，直接分化出不定芽，从而获得再生植株的受体系统 研究显示，采用叶片、幼茎、子叶、胚轴以及一些营养变态器官为外植体时，在适

5、宜的培养技术控制下，均可直接分化出芽,不经过愈伤组织的受体系统,特点 获得再生植株周期短，操作简单 体细胞无性系变异相对较小，可较好的维持受体植株的遗传特性 转化的外源基因能稳定遗传（特别是茎尖） 同样可能出现较多的嵌合体 外植体直接分化出芽较难，转化细胞直接分化成植株难度更大,注意问题 直接分化受体系统比较适合于无性繁殖植物 选材：从组织类型上讲，子叶、叶片、胚轴和某些营养变态器官通常比较容易诱导；从细胞状态上讲，薄壁细胞状态外植体较容易诱导,原生质体由于除去了细胞壁的屏障，能够直接高效的摄取外源DNA或遗传物质，甚至细胞核 适合于现在建立的所有转化方法,原生质体再生系统,特点 原生质体受体

6、系统利于准确的转化和鉴定 转化原生质体获得的转基因植株嵌合体少 但由于目前许多植物的原生质培养体系还不成熟，受原生质体培养技术的限制，转化试验的重复性较差 原生质体培养周期长，受体细胞本身的体细胞变异频率高，遗传稳定性差,经过筛选和优化的植物细胞悬浮培养的细胞系，具有较好的遗传和生理一致性，经过培养基调节，可形成体细胞胚 培养技术相对于原生质体培养来说要容易得多，转化效率又优于其它组织培养系统 被认为是最为理想的基因转化受体系统,细胞系及其体细胞胚受体系统,特点 胚性细胞繁殖量大，同步性好，具有较强的接受外源DNA的能力，转化率高 转化后胚性细胞可通过体细胞胚途径发育成完整植株，嵌合体少 体细

7、胞胚具有双极性，减少了不定芽发育途径中的生根培养过程 来自同一体细胞胚的后代个体间遗传背景一致，无性系变异小,以生殖细胞如花粉粒和卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统称为生殖细胞受体系统，也叫种质系统 途径：利用小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织细胞，建立单倍体的基因转化受体系统；直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管通道法，花粉粒浸泡法和子房微注射法,生殖细胞受体系统,特点 具有更强的接受外源DNA的潜能 转化的基因无显隐性的影响，利于性状的选育，加倍后可迅速获得纯合二倍体新品种 花粉管通道法将现代的分子育种与常规育种紧密结合，是十分有潜力的受体系统 在花粉或小孢

8、子培养技术成熟的植物种类中，利用花粉或小孢子培养系统作为受体系统更为理想,建立一个好的受体系统是实现基因转化的先决条件 受体系统的建立主要依赖于植物组织培养技术，而且要求比一般的组织培养技术要高,第三节 植物基因转化受体系统的建立,高频再生系统必须满足4个条件： 外植体的组织细胞具有诱导愈伤组织和再生完整植株的能力，并且最好是外植体能直接分化出芽 芽的分化率要高 易于离体培养，具有高度可重复性 体细胞无性系变异小,一、 高频再生系统的建立,外植体的选择 外植体的生理年龄 外植体细胞的生理状态 外植体的遗传背景 外植体的选择与受体系统类型匹配,培养基的选择 植物的营养特性 选择原则 激素的选择,

9、受体系统建立时，需要对相关的抗生素种类及其浓度进行试验筛选（抗生素敏感性试验） 抑制农杆菌生长的抗生素种类和浓度的筛选要考虑植物种类和农杆菌株系两个方面 对植物细胞无毒，不显著抑制植物细胞生长 浓度以能够抑制农杆菌生长而不妨碍植物生长的浓度为宜 用于转化子筛选的抗生素浓度的确定,二、抗生素敏感性,农杆菌介导的基因转化是目前植物基因转化中使用较广、技术较成熟的实验体系 选择农杆菌敏感性较高的受体植物及其适宜的组织细胞类型是成功转化的重要因素 转化前可用野生型农杆菌进行侵染试验，筛选敏感性材料,二、农杆菌敏感性试验,再生能力及其遗传稳定性 愈伤组织褐化 再生植株玻璃化 影响受体系统转化效率的因素

10、农杆菌菌株 Vir基因活化的诱导 外植体的类型和生理状态 外植体的预培养 外植体的接种及共培养 转化细胞的选择培养和转化植株再生,第四节 受体系统常见的问题及其解决途径,1.以原生质体或细胞为受体的直接基因转移,2.载体介导的基因转化,3.种质系统介导的基因转化,1.以原生质体或细胞为受体的直接基因转移 聚乙二醇法(Polyethyleneglycol，PEG) 电激法(Electroporatio，Ep) 脂质体法(Liposome，Lip) 磷酸钙DNA共沉淀法(Ca-P) 显微注射法（Microinjection，Mi） 基因枪法（Particale bombardment, PB；Particale gun） 超声波法（Uls）,基因枪,1987年由美国康奈尔大学Sonford等人设