第六章+基因重组.ppt

1、第六章 DNA重组及重组DNA技术 Chapter 6 DNA Recombination and genetic engineering,同源重组(homologous recombination) 位点特异性重组(site-specific recombination) 转座重组(transposition recombination) 不正常重组(iilegitimate recombination) 人工重组（artificial recombination）,DNA重组类型：,四种DNA遗传重组的特征,第一节 同源重组(homologous recombination),一、概述 概

2、念：发生在同源DNA序列之间的重组称为同源重组。 二倍体真核生物: 交换（ crossing over） 真核生物中，精卵细胞发育过程中进行减数分裂时非姊妹染色单体之间发生的DNA交换。 联会（Synapsis）: chromosome pairing. 减数分裂时同源染色体配对 非姊妹染色单体中DNA片断的等价交换,单倍体原核生物：recA-dependent, Holliday model.,同源重组是同源依赖的，而不是序列依赖的 。 基本特征：这种重组方式要求两段DNA序列相似或相同，并在特定的重组蛋白或酶的作用下完成。 基本功能：遗传混合和DNA修复。 作用：真核基因组的遗传作图和基因

3、克隆。,同源重组的几种形式,二、同源重组的机制,DNA受紫外光、X-射线、化学药剂的处理，双链就断裂或产生缺口或产生单链区，增加DNA交换的机率。 在复制、修复过程中，因细菌DNA连接酶和DNA聚合酶I的基因发生突变而失活。 限制性内切酶切割供体DNA，有利于受体DNA的重组。 减数分裂过程中，联会染色体的偶然断裂诱发重组酶的活性，原核生物的基因接合或交换等。,（一）重组起点的产生,（二）同源重组机制,1. 断裂重接(Breakage and reunion )：指一种遗传重组的模式，其中两个DNA双链分子在相应的位置打断并十字交叉重新连接(涉及在连接位点异源双链的形成)。 P165-166,

4、2. 异源双链,异源双链(heteroduplex DNA)：含有由两个亲本DNA单链区域组成的双螺旋。,3. 支链迁移 P166-167branch migration,两个双螺旋形成的交叉连接位置相对起始位置以拉链式效应发生移动。,支链迁移:双链DNA分子中的一条碱基配对的链被另一条也是配对的链代替的现象。 前提条件：DNA分子中存在breathing,4. DNA分子配对P168-170,稳定配对依赖的两个条件：DNA分子必须是单链或具有单链区；两个分子都必须有自由末端。 配对过程 RecA蛋白结合于单链DNA 联会 链交换,三、同源重组的步骤,两条同源DNA链的断裂和同源DNA链的配对

5、（联会） 链转移（包括起始、链的交换和分支迁移） 修复 解离,几个概念,连接体：两个配对DNA双螺旋同源片断的相应位点发生断裂，由此产生的自由末端可以移动，每个单链与相对应的另一个双螺旋上的互补链交叉配对。 连接分子(joint molecule)：一对相连的双链DNA。 重组体连接点(recombinant joint)：一个DNA分子上的一股单链与另一个双螺旋的交叉位点。 异源双链(heteroduplex DNA)：含有由两个亲本DNA单链区域组成的双螺旋。 解离（resolution）：参与重组的DNA分子的分离切割过程。,四、同源重组模型 P178-182,Holliday模型 不对

6、称链转移模型,1. Holliday模型,双链在对等位置产生缺口 断裂处解旋释放出单链 单链与另一分子中的完整链互补配对形成分子间DNA的交换 对称产生切口,两个DNA分子分离.,Holliday结构,重组中，连接两个DNA双链的交换中间物含有4股DNA链，在其连接点为了转换配对所形成的交叉链的接头，称为Holliday结构。 在连接点上主链能自由旋转，使链交换时不失去碱基对，能等价消除拓扑束缚力。,最终结果： 含有异源双链的非交换重组双螺旋。 有交换的重组双螺旋。,解离：参与重组的DNA分子的分离切割过程。,形,2. The Meselson-Radding Model不对称链转移模型,其中

7、一个分子产生切口 替换(displacement) 侵入(inversion) 环切割(loop cleavage) 同化（assimilation） 异构化：参与重组的DNA分子的每条链发生重排并形成Holliday交叉 支链迁移 解离（resolution） P182的三种情况,3、 8字形分子的解离,五、参与同源重组的蛋白质P183-191,和切口处的单链DNA结合，阻止其与互补序列配对和联会。 启动单链转移并帮助侵入链在受体DNA螺旋中扫描同源区域 促进链的交换。,1、RecA酶的作用,2、RecBCD酶及其作用,RecBCD酶：具有解旋酶活性、外切核酸酶活性、ATP酶活性 只作用于双

8、链DNA的平末端（体外实验系统） 在序列（CHI位点）产生单链3末端，引起重组起始。 RecD解离， RecBC继续前进。,Chi sequemce (Chi序列)：一个提供E.coli中RecA 介导遗传重组热点的八聚体序列。,The RecBCD pathway of homologous recombination,3、参与同源重组的其它蛋白质,RuvA：活性状态是四聚体，与Holliday交叉点结合，使4条DNA单链片断处于分离态。DNA解旋酶活性 RuvB： 分子泵和ATP酶活性 RuvC：切开Holliday 结构产生DNA重组,真核及其它同源重组酶,人和酵母：RAD51催化同源D

9、NA片断配对、介导单链侵入及寻找同源序列。 Cre蛋白：催化位点专一性重组,同源重组的意义,产生遗传多样性 重组修复DNA损伤,第二节 位点专一性重组 P173-176Site-Specific Recombination,1. 两个非同源双链DNA分子间发生在特定位点的同源交换 2. 由某些蛋白质识别这些特定位点的DNA序列介导完成重组,Example 1: 噬菌体的基因组插入到宿主细胞大肠杆菌染色体的特定位点 Example 2: 真核生物中抗体多样性的产生,一、噬菌体的整合,外来DNA侵入宿主细胞，并与宿主细胞DNA进行重组，成为宿主细胞DNA的一部分，这一过程称为整合。 整合后的外来D

10、NA仍然可随染色体DNA一起复制，并在适当的条件下进行表达，但也可在相当长的一段时间内不表达。,在整合酶的催化下，两段DNA序列的特异位点处发生整合并共价连接，称为位点特异性重组。 特点：需要短的同源序列导引，在结合序列部位由专一的酶催化断裂基因；交换是相互的和保守的（保存原先的DNA）。,（一）噬菌体整合和切除及所需条件,Episome (附加体)：能够整合进细菌DNA 中的质粒。 Integration (整合)：病毒或者其它DNA序列插入到宿主基因组中，并且与宿主DNA序列两端共价结合。 Excision (切除)：噬菌体、附加体或其它序列的切除是指它们以自主DNA分子形式从宿主染色体中

11、释放出来。,1、DNA位点,Att sites (Att位点)：在噬菌体和细菌染色体中将噬菌体插入或切除细菌染色体的位点。 噬菌体：attP，由POP序列组成。 细菌：attB，由 BOB序列组成。 序列O是核心序列（core sequence）B、B、P、P是臂（arm）。 重组体：attL(BOP) 和attR(POB),2、蛋白质因子,整合酶( integrase)： 噬菌体编码整合酶，能将 噬菌体DNA插入大肠杆菌染色体。在两条DNA的专一位点上进行重组合并成一环状分子。 Int蛋白：噬菌体int 基因的产物，有切断和连接DNA及解旋作用。 Xis蛋白：噬菌体xis基因的产物，抑制整合

12、作用。 整合宿主因子（integration host factor, IHF）:大肠杆菌基因him A、him D编码的两个蛋白质亚基，分子量20kD。,整合和切除反应所需条件,整合体(intasome)： Int和IHF蛋白结合到 attP位点形成的复合物。,（二）位点专一性重组的机制,Int蛋白切断attP和attB中特定位点的磷酸二酯键，在DNA的3-磷酸基团和Int酶的酪氨酸侧链间形成新的共价键，以保持键能（注意：与RecBCD同源重组的区别）。 5羟基末端攻击同源序列的DNA -酶共价键，产生Holliday接头，完成DNA交换和重组。,二、细菌基因转移与重组1、接合作用 P82-

13、83,当细胞与细胞相互接触时，DNA分子即从一个细胞向另一个细胞转移，这种遗传物质的转移方式称为接合作用（conjugation）。 接合作用的典型的例子是细菌所含的一种质粒DNAF因子，该因子含细菌性鞭毛蛋白编码基因，当F+细菌与F-细菌接触时，性鞭毛连接就会在两细胞间形成，F因子被酶切成单链并通过性鞭毛连接桥向F-细胞转移，从而使F-细菌转变为F+细菌。,大肠杆菌三种类型,F-：细胞中无F因子；F+细菌：F因子处于自主复制状态的细菌（存在于细胞质中）；高频重组细菌(Hfr) ：F因子整合在染色体上的细菌。 F+ 细菌与F-细菌接合时,重组体出现频率很低（约10-6）。但F因子的转移频率很高

14、，很快地能使与F+细菌接触的F-细菌的一部分转变为F+细菌。 高频重组细菌与F-细菌接合时重组体出现的频率非常高，可比相应的F+F-接合的重组频率高出上千倍，但F因子本身很少转移,所以接合后所产生的重组体一般仍是F-细菌。 整合在Hfr染色体上的F因子又可脱离染色体而恢复游离状态,从而使Hfr细菌转变成F+细菌，当F因子从Hfr染色体脱离时可以带有部分Hfr细菌的染色体而形成F因子,F因子又可通过交换而整合到细菌细胞染色体上。 F-细菌也可通过获得F因子而改变遗传性状,这一过程称为F因子转导或性导。,可接合质粒，如 F 因子(F factor),2、转化作用,1943年，Avery将有毒型肺炎

15、双球菌DNA与无毒型肺炎双球菌一起培养，结果使无毒型肺炎双球菌转变为有毒型肺炎双球菌。其原因就是有毒型肺炎双球菌DNA进入无毒型肺炎双球菌中，引起其遗传性状改变。,转化作用(transformation)：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。 由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程。,当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。,3. 转导(transduction),整合在宿主细胞染色体DNA中的外来DNA，可以被切离出来，同时也可带走一部分的宿主DNA，这就是转导

16、(transduction)。来源于宿主DNA的基因称为转导基因。 噬菌体感染宿主细胞后出现的溶菌途径和溶源菌途径就是典型的整合和转导的例子。,转导类型,专一性转导：由转导噬菌体介导，只能转导细菌染色体上某一特定基因片断。 普遍性转导：鼠伤寒沙门氏菌含有温和性噬菌体P22，它能转导细菌的任一基因。,转染(transfection),噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。 通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。 转染是转化的一种特殊形式。,生物学意义,调节基因表达： 使基因（插入片断）倒转或

17、去除插入片断，如锥虫表面蛋白。 沙门氏杆菌利用重组的倒转（相变）使两种鞭毛蛋白交替表达。,第三节 转座重组P91-103,转座又称为转位（transposition），是指DNA的片段或基因从基因组的一个位置转移到另一个位置的现象。 1940s, Barbara McClintock在研究玉米遗传时发现转座子。 此后，在真菌、细菌和人类自身基因组中都发现存在转座子（transposons）。,（一）概述,转座子(transposons),转座子(transposons)是可从一个染色体位点转移到另一个位点的分散的重复序列，含两个反向重复序列、一个转座酶基因或（和）其他基因（如抗生素抗性基因）。

18、 这些能够在基因组中自由游动的DNA片段包括插入序列和转座子两种类型。,注意区分几个概念：转座子、质粒、病毒、噬菌体(P80-90),发生转座时的特点,1. Requires no homology between sequences nor site-specific 2. Relatively inefficient 3. Require Transposase encoded by the transposon ( 转座因子）,Various transposons:,In E. coli: IS elements/insertion sequence： 1-2 kb, comprise

19、 a transposase gene flanked by a short inverted terminal repeats Tn（transposon） transposon series： carry transposition elements and -lactamase 内酰胺酶(penicillin resistance) Eukaryotic transposons, many are retrotransposons: Yeast Ty element encodes protein similar to RT (reverse transcriptase),1 、插入序列

20、（Insertion sequences， IS ），以IS加鉴定类型编号来表示。典型的插入序列是长750-1500bp的DNA片段，由两个分离的反向重复序列和一个转座酶基因组成。当转座酶基因表达时，即可引起该序列的转座。如大肠杆菌染色体和F因子上的IS。（P90-95） 其转座方式主要有保守性转座和复制性转座。,2、复合转座子(Composite transposons): 两个重复序列夹着一个或多个结构基因。广为人知的结构基因（对寄主有用的基因）是抗生素标记基因。（P96）,Bla=Ampr,转座子结构特征,两装有短的反向重复序列（20-40bp） 具有编码转座酶的基因,Cohen证明插入

21、序列含有反向重复序列,（二）转座子的转座机制,1. 转座类型 复制型 非复制型 保守型（是非复制型转座的一种形式。转座时，转座子从供体位点上切除，插入到靶位点上，且每个核苷酸键都能保存下来）。,2. 转座机制,1. 靶DNA产生交错切口，转座子插到切口处； 2.突出单链末端与转座子两端的反向重复序列相连； 3.DNA聚合酶填补缺口，DNA连接酶封闭切口。,（1）保守型： 转座后在转座子两侧宿主产生短的正向重复序列,（2）Tn3复制型转座： 转座子作为可移动的元件被复制，一个拷贝留在供体中，另一个拷贝插入受体中。 需要转座酶和解离酶。,复制转座过程： 1. 供体质粒和受体质粒融合成共合体（coi

22、ntegrate），由Tn3转座酶基因 tnpA产物催化，并复制转座子。 2 . 共合体的拆分，转座子的两个拷贝分别进入转座子质粒和Tn3质粒中。由tnpR基因产物催化。,Cointegrate structure (共合结构)：两个复制子融合产生的结构，一个复制子带有一个转座子，另外一个缺少，但是整合体中出现两个在复制子汇合处的转座子，方向是正向复制。,（3）非复制型转座 （需要复制酶） 两种质粒产生切口，形成有游离末端的片断。 切口交错连接。 产生新切口，释放出无转座子的供体质粒，转座子附着在靶DNA上。 靶质粒填充和封闭缺口。 供体质粒可能得到修复或丢失。,转座模型,免疫球蛋白重链基因由

23、一组可变区基因（VH）和一组恒定区基因（CH）构成，通过这些基因的选择性转座和重组，就可以转录表达出各种各样的免疫球蛋白重链，以对付不同的抗原。,（三）转座子的遗传学效应 P99,引起插入突变 插入位置上出现新的基因 造成插入位置上出现靶 DNA 的少数核苷酸对的重复 转座后原来位置上保持原有的转座子 引起染色体的畸变 切除（切离）,转座子在遗传学中的应用,基因转移 基因定位标记 筛选插入突变 构建特殊菌株,第三节 重组DNA技术及其应用,重组DNA技术又称为基因工程（genetic engineering）或分子克隆(molecular cloning)。 基因工程的操作过程主要由以下步骤组

24、成：载体和目的基因的分离；载体和目的基因的切断；载体和目的基因的重组；重组DNA的转化和扩增；重组DNA的筛选和鉴定。,一、重组DNA技术相关概念,（一）DNA克隆（也称基因克隆或重组DNA） 应用酶学的方法, 在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成具有自我复制能力的DNA分子，再通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提取获得大量同一DNA分子。,生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等,基因工程-实现基因克隆所采用的方法 及相关的工作称基因工程, 又称重组DNA工艺学。 目的 ：1、分离获得某一感兴趣的基因或DNA序列 2、获得感兴趣基因

25、的表达产物(蛋白质),（二） 工具酶（P424-429）,概 述,1 限制性核酸内切酶,1.1 引言-核酸酶和限制性核酸内切酶的定义 1.2 限制性核酸内切酶的命名 1.3 限制性核酸内切酶的分类,核酸酶（Nuclease）： 通过切割相邻两个核苷酸残基之间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。 1）按作用对象可分为: Deoxyribonuclease (DNAase) & Ribonuclease (RNAase) 2）按水解断裂核酸分子不同方式可分为： Endonuclease & Exonuclease,1.1 引言-核酸酶和限制性核酸内切酶的定义,限制性核酸内切酶(re

26、striction endonuclease)：识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,BamH,1.2 限制性核酸内切酶的命名,命名原则： 第一个字母（大写, 斜体）： 该酶来源的微生物属名； 第二、第三个字母（小写、斜体）：微生物的种名； 若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母（大写） 若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。,例如：EcoR 从大肠杆菌（Escherichia coli) R株分离的第一种限制酶命名为EcoR， 其中E 代表属名（Escherichia)，co 代表种名（co

27、li)，R 代表株系（RY13）， 代表该菌株中首次分离到。,1.3 限制性核酸内切酶的分类,1.3.1 型限制性内切酶 1.3.2 型限制性内切酶 1.3.3 型限制性内切酶,1.3.1 型限制性内切酶,功能：限制、修饰 特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点（随机性）； 应用：不常用。,1.3. 2 型限制性内切酶,功能：限制、修饰 特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，切割位点在识别位点外，距识别位点3端24-26bp处。 应用：数量很少，分子克隆中无实际作用。 型和型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的

28、部分亚基有对特殊碱基进行甲基化修饰的活性。,1.3.3 型限制性内切酶,功能：识别并特异切割DNA分子。 即通常所指的DNA限制性核酸内切酶； 反应特点：仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，能识别双链DNA的特殊序列，并可特异切割DNA，产生特异性的片段；型限制酶水解DNA不需要ATP也不以甲基化或其它方式修饰DNA。 应用：种类繁多，分子克隆中最常用。,(1) 基本特性,识别长度为4-8个核苷酸的特异序列； 许多识别序列具回文结构. 切割产生的末端有粘端 (cohesive/sticky end) 如BamH I (GGATCC) 和平端 (blunt end) 如Sma I (CCC GG

29、G),BamH,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,Recognition Sequences and Cutting sites of selected Restriction Endonucleases,(2) 同功异源酶,来源不同但能识别和切割同一位点的酶称为同功异源酶 (isoschizomer), 有时也称同裂酶。 如：BamH I (GGATCC)和Bst I (G GATCC) 有一些同功异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感度有所不同。,(3) 同尾酶,有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶（isocaudamer) 如： BamH I : GGAT

30、CC Bgl II: AGATCT,（三）目的基因（又称外源DNA）（P428-430） cDNA：经反转录合成的、与RNA（mRNA或病毒RNA）互补的单链DNA。 基因组DNA：在真核生物体，基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）和线粒体DNA的全部序列。,（四）基因载体（克隆载体）：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。,克隆载体(cloning vector)：为使插入的外源DNA序列被扩

31、增而特意设计的载体。 表达载体(expression vector)：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。,二、重组DNA技术基本原理及步骤,1、目的基因的获取 2、基因载体的选择与构建 3、目的基因与载体的拼接 4、重组DNA分子导入受体细胞 5、筛选并无性繁殖含重组分子 的受体分子（转化子）,（一）目的基因的获取（P428-430）,直接从染色体DNA中分离 从基因组文库中筛选 从cDNA文库中筛选 人工合成目的基因 PCR扩增目的基因,1直接从染色体DNA中分离： 仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。 2从基因文库中筛选： 将某一种细胞DNA用适当的限制酶切断后

32、，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomic DNA library)。 将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。,基因组文库的制作,3从mRNA合成cDNA： 采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。,4人工合成： 根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺

33、序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。,5利用PCR合成： 如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。 条件：耐热DNA聚合酶（Taq酶）；模板DNA；两种引物；四种脱氧核糖核苷酸；缓冲溶液。,（二）克隆载体的选择 常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA,载体的选择标准： 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA

34、。,（三）外源基因与载体的连接（P430-435）,末端种类,DNA 经限制性内切酶处理后，其末端包括： 两个不同的粘性末端 两个相同的粘性末端 一个粘端, 一个平端 两个平端,1、粘性末端连接： 同一限制酶切割位点连接 配伍末端连接,2、平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 3、同聚物加尾连接 由末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,4、人工接头： 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,（四）重组DNA导入受体菌（P435-438） 受体菌条件： 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态,导入方式：转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (inf