亲和原理篇.ppt

1、亲和色谱，内容，1 .原理2 .凝胶及其应用3 .色谱战略，1 .原理，亲和色谱是指通过生物分子的生物相互作用进行生物分子分离的液相分离技术。 从平衡上的结合/洗涤溶出，从平衡色谱柱到样品能够结合的状态，仿射色谱，在能够结合的状态下结合/洗涤溶出样品，仿射色谱的主要步骤， 平衡：使亲和层析成为可以与目标物结合的状态样品洗提下的目标物恢复：使填料成为可以与目标物结合的状态重新平衡，亲和层析，Equilibration，Sample application，waw 易于精制无法用其他方法分离的蛋白质：例如，从改性蛋白质中分离天然蛋白质及其不同功能的亚型，通常以超过95 %的纯度从大量杂质中分离高纯

2、度的目标物质， 可以特异性地除去杂质配体3360特异性地与目标物结合的基台3360是与配体结合的内部填充剂结合3360配体与基台间的共价键3360配体与目标物间的结合、仿射色谱中的用语、仿射填充剂， 金属螯合物：反复螯合不同的金属，结合依赖于不同金属的蛋白质，一个介质可以进行多种精制作业的活化偶联剂：最常用的是NHS activated 4 Fast Flow和CNBr activated 4 FF小配体亲和：精制抗凝血凝血因子脂肪酶等抗体亲和：颜料亲和：精制白蛋白、干扰素等外因凝集素亲和：刀豆球蛋白A -多糖。 (His组氨酸、Cys半色氨酸、Try色氨酸)填充剂类型： IMAC Sepha

3、rose :固定化金属离子亲和色谱填充剂，底架被活化，可直接用于金属离子键。 Ni Sepharose :已与Ni离子结合，可直接用于His蛋白的纯化，承载量极高，脱落极低。 Chelating Sepharose :亚氨基双乙酸键的填料可以键合不同的金属离子，脱落率低。(详见Tag-protein.ppt )，最常用的是NHS activated 4 Fast Flow和CNBr activated 4 FF填充物类型：活化耦合亲和填充物，耦合方法1 (2)， chemicalgrouplengthofstructureofproductonligandspacerarmspacerarm、

4、Proteins、peptides、aminoacidsamino 10-atomhitrapnhs-active 10-atomechsepharose4bcarboxyl 11-atomeahsepharose4b thiol4- atomthiopropylsepharose6b 10-atomactivatedthiolsepharose Eph arose6b o、n、n、n、n、s、o、s、n、n、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I、I n，o，h，o，o，h，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o

5、，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o，o n chemicalgrouplengthofstructureofproductonligandspacerarmspacerarm是sugars hydroxyl 12-atom epoxy -有源sepharose6b amino 10 xyl11-atomEAH Sepharose 4B，可以是，o，可以是，但是，可以是，但是，可以是，不能是，不能是，不能是，不能是，不能是，不能是，不能是，不能是，不能是，不能是。 様式，様式，様式，様式，様式， polyn

6、ucleotidesaminonecnbr -主动式sepharose4bcnbr -主动式sepharose 4快速流动式mercuratedbase4-自动式propylseppropyl co steroids amino，carboxyl，thiolorhydroxylusematrixwithspacerarm (see above )，o，o，h，n，h，2，o，可以，可以，可以，可以，可以，可以，可以，可以，可以，可以，可以一个词，一个词，一个词，一个词，一个词，一个词，一个词，一个词，一个词，一个词，一个词，一个词，一个词。 mouseiggonhitrapnhs -激活的主页

7、、1 ml、行1.e路由材质、非重复行2.lmwcalibrationkit、reed cnbr -激活的，cnbr -激活的cnbr -主动式sepharose 4基盘3和传输0.1 mna HCO 3。 ph 8.3 for pre-hydrolysis.samplesremovedafterdifferenttimesandtestedforcouplingactivitytowardsa-chymotrypsinogen 激活耦合亲和性填充物，激活耦合亲和性填充物，激活耦合亲和性填充物，激活。 Partial structures，ECH Sepharose 4B，EAH Sephar

8、ose 4B，Partial structures，活性偶联亲和性填充剂，ECH EAH Sepharose，epoxy-。 carbonate/bicarbonatebuffersph 911 naohsolutionph 1214.ligandconcentrations 3360和20毫克/毫升，n-acetyl-d-galactosaminetoepoxy Coupled ligand moles/g conjugate，g lycyl-leucinetoepoxy-activated sepharose6b，耦合亲和性填料的活性化， epoxy-activate ed mixed d

9、i sulphide格式(1)，可恢复性能可恢复性增强技术(dtt ) (2) . mixeddisulphidefoot2- dipyridyldisulphide :2-thiopyridylderivativeforcovalentchromatography (3) . reactionwithheavymetalsandderivativese.g.pchloromercuribenzoate (4) : mercaptideformation.treatmentwithalkylorarylhalides : thioetherderivatives (5).addition re

10、actions (6)超级协议小配体亲和性填充剂、填充剂预先结合不同种类的小配体，结合不同的特异性激酶、重组蛋白或其他活性物质等。 填充剂类型： Glutathione Sepharose:填充剂中已经结合了谷胱甘肽，可以结合含有S-转移酶的重组蛋白质。 Heparin Sehparose :提纯抗凝血酶、凝血因子脂肪酶等。 Benzamidine Sepharose :特异性结合丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶等。 其他填充剂：纯化不同的蛋白质。(详细的Glutathione Sepharose信息请参照Tag-protein.ppt )，绑定capacitymaximumcommentso

11、peratingflow， 高爆炸性次品、高爆炸性次品、高爆炸性次品、高爆炸性次品、高爆炸性次品、高爆炸性次品、高爆炸性次品、高爆炸性次品liganddensitycompositionphstabilitymeanparticlesize、Benzamidine Sepharose Trypsin、35mg/ml中型300厘米/hsuppliedasa 4快速流程benz amidine 12 molesamidecouplingofligandshortterm 1990 msepharose4p-aminobenzamidine/mlv IAA 14 atomspacertolongte

12、rm 28快速流动、o、h、o、o、h、h、f、f、f、f、f、f、f、f、o、o、h、h、h、f、f、f、f、f、f、f、o、o、o、o、o、o、o、o、o、o、o、o、o、o、o、o、o、o、o、o/removalofserineproteasesfromhumanplasma，on hit rap benz amidine ff (高子)，1 ml，10-3 x，配体亲和性填充剂， benzamidine柱上GST融合蛋白酶切及其thrombin酶的去除、sh2- gstfusionproteinine.colihomogenate、ongstrapffandhitrapbenzamidineff (高sugh mlmaximumcommentsmediumoperatingflow、ligandcompositionphstabilitymeanparticledensitysize、argine sepharose4bnodataavailable 7 arginine sepharose4b 1420 arginineiscoupledbyanepoxyshortterm 21390 mmol es/mlcouplingmethodthrou