实时荧光定量PCR在临床及科研中的应用.ppt

1、实时荧光定量PCR在临床及 科研中的应用,主要内容,Real Time PCR 用途及原理,Real Time PCR 几种方法介绍,Real Time PCR 技术应用,Real Time PCR 应用实例,差异显示结果验证,定性分析,绝对定量,相对定量,病毒和病原菌检测,基因芯片结果验证,siRNA效果确认,mRNA表达量分析,Real Time PCR 用途,操作简单，无需电泳，检测快速，降低污染几率， 适用于大量样品检测，检测灵敏度高； 可以在宽广范围内进行准确定量。,生物品种鉴定,病毒和病原菌定量分析,导入基因拷贝数解析,GMO定量检测,SNP解析,Ct值,Real Time PCR

2、 原理,使用Real Time PCR扩增装置，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,Real Time PCR 原理,荧光阈值 Threshold：突破背景荧光水平后的荧光值.,阈限循环 Ct ：荧光信号达到阈值时的循环数.,突破Ct以后， 荧光以指数形式增加, 然后线性增加，并最终进 入平台期,Ct值的特点： 终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性,Real Time PCR 原理,定量PCR通过Ct和初时模板量的关系进行定量。 同一样品的96个重复的终点荧光强度差别很大，但是Ct相同。,Cycle,Real

3、 Time PCR 原理,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作 出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。,Real Time PCR 检测方法,核酸染料技术 代表：SYBR Green I (SGI) 荧光探针技术 代表：TaqMan probe,SYBR Green I 与dsDNA结合 SGI 与dsDNA结合后受激发荧光强度增加1000倍 随着产物的积累，越来越多的SGI与dsDNA 结合， 使得荧光信号增强.,Real-Time PCR检测原理(SYBR Green I法),SYBR

4、 Green I PCR检测的特点,优点 仅需要一对引物，实验设计简单。 扩增后可进行产物的熔解曲线分析，以确定特异性。 实验成本低。 不足 特异性仅由引物保证。 非特异性双链DNA也会产生荧光信号。 不能用于多重Real-Time PCR。,Real-Time PCR检测原理(TaqMan probe法),TaqMan探针为一寡核苷酸: 5端标记一个报告荧光基团(Reporter)， 3端标记一个淬灭荧光基团(Quencher)。,Q,R,1. PCR过程中，探针与模板的特定序列结合,2. DNA聚合酶的 5- 3 核酸外切酶活性，将探针水解，从而破坏荧光基团和淬灭基团之间的FRET,3.

5、照射报告基团发出可检测的荧光信号,R,4. 随着PCR扩增的进行，荧光信号不断积累,Real-Time PCR检测原理(TaqMan probe法),优点 靶标特异的荧光信号 高度的检测特异性 可用于多重Real-Time PCR 不足 探针合成成本高,TaqMan probe 法PCR检测的特点,SYBR Green I法vs Probe法,SYBR Green I 法 优点：价格便宜、使用方便、无需合成特异性探针。 缺点：引物要求高(要求特异性扩增)、不能进行多重PCR。 Probe法 优点：特异性强，能进行多重PCR。 缺点：需要设计特异性探针，成本高、有时设计困难。,使用SYBR Gr

6、een I 进行检测的问题点,SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反 应体系中有非特异性扩增，非特异性DNA也将同时被检测， 从而可能导致检测结果不准确。 Primer Dimer的产生 二条引物的3端具有互补序列时，引物自身也会进行扩增， 产生短链DNA片段（Primer Dimer）。,3,3,使用 SYBR Green I 进行定量 PCR 的 Key Point,Primer： 设计合适引物，防止非特异性扩增，是使用 SYBR Green I 进行定量 PCR 的Key Point。,Real Time 进入 SYBR Green I 时代,设计合适的引物

7、选择适当的反应条件 使用良好的试剂,保证以上条件，使用SYBR Green I将会更加便宜，更为方便，并拥有良好的特异性。,目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。,目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。,Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同,= 对引物设计要求严格,普通PCR引物,Real Time PCR引物,Real Time PCR引物及探针设计,Real Time PCR用引物设计原则,号表示重要程度，号越多，表示该参数越重要，设计时要优先考虑,目的基因序列获得,好的引物 需要寻找好的参照序列,引物设计,分析

8、序列,特异性确认,基因组序列确认,RefSeq序列,目的基因,Real Time PCR引物及探针设计,Real Time RT-PCR 引物,（/RefSeq）,通过NCBI获得参考序列和相关情报。RefSeq数据库提供无重复，准确性，完整性的基因参考序列。 序列可信度高，信息量大,NCBI:,The National Center for Biotechnology Information,NM_008777,RefSeq,评价,Pah,Pah,Pah,Pah,X51942,BC013458,BI330290,BF789560,X5194

9、2,BC013458,BI330290,BF789560,Pah,Pah,GenBank,Real Time PCR引物及探针设计,苯丙氨酸羟化酶,NCBI提供目的基因相关信息： （基因名、染色体上的位置、Accession、表现型、文献索引、同源性等其他数据库以及功能、蛋白质图谱等） 基因词典,Real Time PCR引物及探针设计,LOCUS NM_008777 1959 bp mRNA linear ROD 15-APR-2005 DEFINITION Mus musculus phenylalanine hydroxylase (Pah), mRNA. ACCESSION NM_00

10、8777 VERSION NM_008777.1 GI:6679202 SOURCE Mus musculus (house mouse) ORGANISM Mus musculus FEATURES Location/Qualifiers gene 1.1959 /gene=Pah /db_xref=GeneID:18478 /db_xref=MGI:97473 CDS 48.1409 /gene=Pah /note=go_function: iron ion binding goid 0005506 /protein_id=NP_032803.1 /db_xref=GI:6679203 /

11、db_xref=GeneID:18478 /db_xref=MGI:97473 ORIGIN 1 aattcaaccc tgtgctaagc tagacacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg 61 tcctggagaa cggagtcctg agcagaaaac tctcagactt tgggcaggaa acaagttaca 121 tcgaagacaa ctccaatcaa aatggtgctg tatctctgat attctcactc aaagaggaag 181 ttggtgccct ggccaaggtc ctgcgcttat ttgaggaga

12、a tgagatcaac ctgacacaca 241 ttgaatccag accttcccgt ttaaacaaag atgagtatga gtttttcacc tatctggata 301 agcgtagcaa gcccgtcctg ggcagcatca tcaagagcct gaggaacgac attggtgcca 361 ctgtccatga gctttcccga gacaaggaaa agaacacagt gccctggttc ccaaggacca 421 ttcaggagct ggacagattc gccaatcaga ttctcagcta tggagccgaa ctggatg

13、cag 481 accacccagg ctttaaagat cctgtgtacc gggcgagacg aaagcagttt gctgacattg 541 cctacaacta ccgccatggg cagcccattc ctcgggtgga atacacagag gaggagagga 601 agacctgggg aacggtgttc aggactctga aggccttgta taaaacacat gcctgctacg 661 agcacaacca catcttccct cttctggaaa agtactgcgg tttccgtgaa gacaacatcc 721 cgcagctgga a

14、gatgtttct cagtttctgc agacttgtac tggtttccgc ctccgtcctg 781 ttgctggctt actgtcgtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact 841 gcacacagta cattaggcat ggatctaagc ccatgtacac acctgaacct gatatctgtc 901 atgaactctt gggacatgtg cccttgtttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg 961 aaattgggct tgcatcgctg ggggcacctg

15、 atgagtacat tgagaaactg gccacaattt 1021 actggtttac tgtggagttt gggctttgca aggaaggaga ttctataaag gcatatggtg 1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac agtactgttt atcagacaag ccaaagctcc 1141 tgcccctgga gctagagaag acagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc 1201 tgtactatgt ggccgagagt ttcaatgatg ccaaggagaa agtg

16、aggact tttgctgcca 1261 caatcccccg gcccttctcc gttcgctatg acccctacac tcaaagggtt gaggtcctgg 1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtgaggtt ggaatccttt 1381 gccatgccct gcagaaaata aagtcatgaa cagaaagtga cgtcatagac agaacttagg 1441 aggtcaacca aaaaaatctg ctgatagaag tatagtaact gcttcttttc cctgaagaa

17、g 1501 aaaagtttta tttgcaatgt cagcttttaa tatattttcc taacatagtg gaggatcacc 1561 aaataaatca atttctctga atgaaagtat attaaaaccc atcagtggta gatccttcag 1621 agtcacattt gatttagata tctcagacct tcaatttggt ttaaaatgta atttctcagt,GenBank file,NM_008777,Mus musculus phenylalanine hydroxylase (Pah), mRNA.,目的基因序列获得,引

18、物设计,序列分析,特异性确认,基因组序列确认,目的基因,Real Time PCR引物及探针设计,Real Time RT-PCR 引物,1 aattcaaccc tgtgctaagc tagacacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg 61 tcctggagaa cggagtcctg agcagaaaac tctcagactt tgggcaggaa acaagttaca 121 tcgaagacaa ctccaatcaa aatggtgctg tatctctgat attctcactc aaagaggaag 181 ttggtgccct ggccaaggt

19、c ctgcgcttat ttgaggagaa tgagatcaac ctgacacaca 241 ttgaatccag accttcccgt ttaaacaaag atgagtatga gtttttcacc tatctggata 301 agcgtagcaa gcccgtcctg ggcagcatca tcaagagcct gaggaacgac attggtgcca 361 ctgtccatga gctttcccga gacaaggaaa agaacacagt gccctggttc ccaaggacca 421 ttcaggagct ggacagattc gccaatcaga ttctcag

20、cta tggagccgaa ctggatgcag 481 accacccagg ctttaaagat cctgtgtacc gggcgagacg aaagcagttt gctgacattg 541 cctacaacta ccgccatggg cagcccattc ctcgggtgga atacacagag gaggagagga 601 agacctgggg aacggtgttc aggactctga aggccttgta taaaacacat gcctgctacg 661 agcacaacca catcttccct cttctggaaa agtactgcgg tttccgtgaa gacaa

21、catcc 721 cgcagctgga agatgtttct cagtttctgc agacttgtac tggtttccgc ctccgtcctg 781 ttgctggctt actgtcgtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact 841 gcacacagta cattaggcat ggatctaagc ccatgtacac acctgaacct gatatctgtc 901 atgaactctt gggacatgtg cccttgtttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg 961 aaattgggct

22、 tgcatcgctg ggggcacctg atgagtacat tgagaaactg gccacaattt 1021 actggtttac tgtggagttt gggctttgca aggaaggaga ttctataaag gcatatggtg 1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac agtactgttt atcagacaag ccaaagctcc 1141 tgcccctgga gctagagaag acagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc 1201 tgtactatgt ggccgagagt ttca

23、atgatg ccaaggagaa agtgaggact tttgctgcca 1261 caatcccccg gcccttctcc gttcgctatg acccctacac tcaaagggtt gaggtcctgg 1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtgaggtt ggaatccttt 1381 gccatgccct gcagaaaata aagtcatgaa cagaaagtga cgtcatagac agaacttagg 1441 aggtcaacca aaaaaatctg ctgatagaag tatagtaac

24、t gcttcttttc cctgaagaag 1501 aaaagtttta tttgcaatgt cagcttttaa tatattttcc taacatagtg gaggatcacc 1561 aaataaatca atttctctga atgaaagtat attaaaaccc atcagtggta gatccttcag 1621 agtcacattt gatttagata tctcagacct tcaatttggt ttaaaatgta atttctcagt 1681 tctcatcaac attcatcaaa tttgggactc atatcatttg ggctctgtct gtt

25、cattttt,CCTGGCCAAGGTCCTGCG,TTGGAACCAGGGCACTGTGT,AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC,TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC,ACTCTTGCGACATGTGCCCTTG,TCTTCTCTAGCTCCAGGGCC,AAAGTCATGAACAGAAAGTGA,GTGATCCTCCACTATGTTAG,Forward,Reverse,目的基因序列获得,引物设计,序列分析,特异性确认,基因组序列确认,目的基因,Real Time PCR引物及探针设计,Real Time RT-PCR 引物,CCTGGCCAAGGTCCTGCG,T

26、TGGAACCAGGGCACTGTGT,AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC,TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC,ACTCTTGGGACATGTGCCCTTG,TCTTCTCTAGCTCCAGGGCC,AAAGTCATGAACAGAAAGTGA,GTGATCCTCCACTATGTTAG,Forward,Reverse,5-,5-,5-,5-,5-,5-,5-,5-,-3,-3,-3,-3,SNP,3 末端的T,3bp互补,目的基因序列获得,引物设计,序列分析,特异性确认,基因组序列确认,目的基因,Real Time PCR引物及探针设计,Real Time RT-PC

27、R 引物,物种选择,参考数据库 RefSeq-rna,WordSize 7,目的基因序列获得,引物设计,序列分析,特异性确认,基因组序列确认,目的基因,Real Time PCR引物及探针设计,Real Time RT-PCR 引物,AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC,TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC,5-,5-,-3,,目的基因序列获得,引物设计,序列分析,特异性确认,基因组序列确认,目的基因,-3,Real Time PCR引物及探针设计,Real Time RT-PCR 引物,TaqMan探针设计原则：,Real T

28、ime PCR引物及探针设计,引物反应性确认,线性关系、扩增效率确认,检测灵敏度确认,引物二聚体确认,PCR扩增效率（E）:0.8-1.2,35Cycles内可得到好的定量结果 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增,30Cycles内无引物二聚体产生,相关系数（r2）：大于0.98,基线平整 Negative control为水平线 指数区较明显，陡度大 平台区汇于一起 线性范围宽,理想的标准品扩增曲线,特异性产物,非特异产物,引物二聚体,对PCR产物特异性进行分析,融解曲线分析,微生物及病原体临床检测 病毒粒子定量检测 细菌定量检测 转基因拷贝数检测 肿瘤研究 基因表达研究 基因突变及多态性SNP研究 其他,Real-Time PCR 在临床及科研中的应用,SNP与表现型的研究,研究举例-1,研究举例-1,鼻咽癌的个体差异,假设前题： IL-12家族基因多态性（IL-12、IL-27）是鼻咽癌个体差异的原因。 实验设计： SNP位点：在IL-12基因上挑选1个基因位点(16974 A/C )；IL-27基因上挑选3个基因位点(-964 A/G, 2905 T/G, 4730 T/C )。 样本组：30