免疫组织化学染色技术20140413.ppt

1、熟悉与陌生的世界免疫学，制作，内容，医学与防疫，第27章免疫组织化学技术，讲师：王兴明，讲师：王兴明，讲师：王兴明，讲师：王兴明，2014年4月15日，讲师：王兴明，讲师：临床上如何处理？例如，免疫组织化学染色：肿瘤细胞CK7(-)，CK20()，CDX2()，提示结肠直肠来源。免疫组织化学：帮助临床诊断！活检：腺癌(转移)，结肠镜检查发现横结肠有12毫米病变，活检证实为腺癌。(CK7和CK20联合使用)，一些免疫标志物决定是否使用靶向药物治疗，而免疫组织化学-指导临床治疗的方向！有利于项目设计和研究工作的开展！免疫组化，第27章，免疫组化，第5节，免疫金银法，第4节，荧光免疫组化，第3节，酶

2、免疫组化染色，第2节，免疫组化关键技术，本章主要内容，第1节概述，第2节概述，免疫组化关键技术(学习难点)，第3节酶免疫组化染色，本课程的任务，免疫组化的概念和原理(重点掌握)，免疫组化分类(理解)，常用免疫组化方法(熟悉程度)，免疫组化特征(熟悉程度)，教学目的和要求， 教学目的：免疫组织化学染色是一种非常成熟的蛋白质检测技术，广泛应用于临床检测，其抗原抗体反应得到应用。 因此，通过这个讲座，学生应该掌握实验的原理，从而达到融会贯通。教学要求：掌握免疫组织化学染色技术的概念和原理；熟悉免疫组织化学染色技术的步骤、方法和操作步骤。了解免疫组织化学和其他相关技术的重要用途(扩展)。第一节概述了免

3、疫组织化学的概念和原理(重点在于掌握)，(一)概念：免疫组织化学是一种通过标记有显示剂(荧光素、酶、金属离子等)的特异性抗体来定位、定性和定量确定相应抗原的技术。)在组织或细胞中通过抗原-抗体特异性反应和原位组织化学显色反应。综合两种技术，借助显微镜检测各种物质。实质：组织化学染色原位示踪技术的发展：免疫荧光-酶标抗体技术、酶抗复合酶技术、胶体金标记技术和亲和标记技术-原位杂交技术和聚合酶链反应技术。(2)免疫组织化学原理(重点掌握)，1。(综述)理论基础：(1)抗原是一种能刺激机体免疫系统产生免疫反应的物质，即产生抗体或致敏淋巴细胞等。并且可以在体内或体外与相应的抗体或致敏淋巴细胞特异性结合

4、。两个特征：免疫原性和免疫反应性。外源性抗原：内源性抗原，如微生物和花粉：隐藏的自身抗原、肿瘤相关抗原和其他同种抗原：人类白细胞抗原、血型抗原、异种抗原：人类和其他动植物之间存在的共同抗原，抗原无处不在。(2)抗体是由B淋巴细胞，特别是浆细胞，经抗原刺激后分泌的一种球蛋白，能与相应的抗原发生特异性反应，称为免疫特性：能特异性结合相关抗原。(3)酶促反应：。酶标记(如辣根过氧化物酶等。)与底物发生酶促反应。酶促反应的特点：效率高，操作具体，条件简单可控。概述：(1) (2) (3)=免疫组织化学的优势：免疫反应的组织化学结合的产物，1。免疫学的基本原理：抗原和抗体结合的高度特异性。化学显色法。免

5、疫组织化学染色原理：特异性反应原理？提取目标蛋白(作为抗原)，获得小鼠I抗体，获得II抗体，根据不同种类的标记抗体，按照染色步骤分类，按照结合方式：抗原-抗体结合：如过氧化物酶-抗-过氧化物酶法(PAP法)亲和连接，其次，免疫组织化学分类，酶-免疫酶荧光染料-免疫荧光铁蛋白-免疫铁蛋白胶体金-免疫金和银法放射性同位素-放射免疫测定，根据不同的标记抗体，按照染色步骤，直接方法：实施例-免疫荧光探针间接方法：标记第二抗体上的酶或具有亲和力的分子实施例：两步、三步和多步方法的优点：提高灵敏度的同时避免多重标记I抗体，图例，间接法：灵敏度三步和两步方法，直接法：特异性一步方法，根据结合方式：抗原-抗体

6、结合：过氧化物酶-过氧化物酶复合物亲和连接法：ABC法S-P法，免疫荧光法。2.特点：荧光显微镜下观察，免疫荧光法，1。目前它被广泛使用。2.原理：抗原抗体反应，酶标记抗体，添加显色底物。3.特点：准确、清晰、长期、兼容。免疫酶标记法，1。标记：特殊金属颗粒-胶体金2。特点：特别适用于电子显微镜的单次或多次标记。它也适用于光镜研究。免疫胶体金技术，电镜下胶体金包埋后染色。免疫组织化学特征：(熟悉度)，1。原地2。颜色反应3。形态、代谢和功能的结合。质、量、量三位一体。强烈的特异性。高灵敏度，原位反应：细胞层掩膜，细胞核和血浆细胞器层，2。显色反应，根据显色的结果不同：荧光标记-荧光素显色酶标记

7、-酶底物显色胶体金技术可以在光学显微镜和电子显微镜下显色，1。原位，形态显色反应代谢，功能抗原含量和位置，4。定性、定量和定位三位一体是否存在？它在哪里？多少人？3.形态、代谢和功能的结合决定了这一特征。免疫组织化学实际上是组织中特定抗原的展示！6、灵敏度高，ABC法和SP法可以使抗体稀释几千倍、几万倍，而且仍能与组织中的抗原结合。5。免疫组织化学技术的强特异性、总结性、原理，用下图来说明上述基本原理：如何具体做免疫组织化学？公司标志，第2节和第3节免疫组织化学技术的基本步骤(困难和实用)，长，时间：标本分离后30分钟内取样，用固定液固定；目标：保持组织形状和结构的完整性；尝试保存组织中的抗原

8、。方法：4%甲醛溶液机制：交联蛋白质固定它们，影响细胞膜通透性，抑制酶消化，从而保护蛋白质免受损伤。1.材料选择，固定，2。组织包埋，目的：使组织保持一定的形状和硬度，易于切片。有很多方法，如石蜡包埋、冷冻包埋、塑料包埋等。烤切片：702小时，完全贴合，3。压片，4。脱蜡：二甲苯溶液，6分钟*5次，然后用乙醇洗去二甲苯水合，洗涤：在PBS中浸泡5min，目的：暴露抗原，改善通透性，增强特异性染色方法：高压修复，柠檬酸钠缓冲液，PH=6.0，0.01米PBS洗涤3次，共5次。失活，6。抗原修复，3%H2O2溶液，室温10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。目的：消除非特异性染色(有内源性荧光、内

9、源性酶、内源性生物素、抗体或标记物不纯和过量等)。)方法：正常山羊血清用密封液密封，室温，10分钟。倒出血清，按适当比例稀释抗体，在37孵育1小时或在4个冰箱中过夜。用PBS洗涤2分钟*3次。7.密封血清。密封后不要清洗！8。特异性抗孵育，9。二抗孵育，滴加50-100微升生物素化的二抗工作液，室温孵育20分钟，PBS洗涤2分钟* 3次；11.在室温下滴加显色剂如DAB约5分钟。注意：在光学显微镜下掌握染色时间；用自来水冲洗5分钟，10。用不同的方法滴加底物，底物有一定的差异。经过详细分析，11。滴加显影剂，用0.1%盐酸-乙醇溶液复染苏木精(细胞核分化，12。反诉，13。“切片”，用自来水充

10、分冲洗，用梯度酒精脱水，用中性胶固定，密封切片，干燥后进行显微镜检查。解释结果时应考虑以下几个方面：a、定位：细胞质(主要)、细胞膜、细胞核、细胞间物质b、阳性细胞数c、染色强度，最后一步：解释结果，在光学显微镜下判断和解释结果。实例：CD44蛋白在食管鳞状细胞癌中呈强阳性，其表达部位为细胞质，乳腺癌、er在癌细胞核中呈强阳性，而在转移性HCC肿瘤中，血管内皮生长因子表现为ABC 200强阳性表达，CD44V6染色，膜阳性，SP法，DAB染色，ABC法，抗生物素蛋白免疫染色法，理论基础：卵清蛋白：抗生物素蛋白，抗生物素蛋白。有四个对生物素具有高亲和力的结合位点。生物素：体内的维生素H。1.它能

11、与卵清蛋白高亲和力结合；2.它能结合抗体IgG的Fc片段，但不影响抗体活性；3.活化后，可与过氧化物酶等结合。并且不影响酶活性。ABC套件，ABC套件，1。阻断血清2。生物素标记的二型抗体3。一种试剂：抗生物素蛋白4。b试剂：生物素-过氧化物酶复合物、P-O、抗原、生物素、抗生物素蛋白、辣根过氧化物酶(HRP)，ABC法图解，sp法，基本原理与ABC法相似，但与ABC法略有不同：它使用过氧化物酶和与生物素标记的第二抗体和链霉菌抗生物素蛋白相连的基质的混合溶液来测定细胞和组织中的抗原。生物素，链霉亲和素，酶：辣根过氧化物酶或辣根过氧化物酶，sp法图解，envision系统染色原理，II抗多聚体酶

12、，形成多聚体，含有大量酶和II抗分子，具有良好的扩增效果，极轻的背景染色，Ag，Ag，一级抗体，二级抗体，酶，AP或辣根过氧化物酶，envision法图解，简要综述：组织抗原，酶标记的II抗体，特异性I抗体，显色剂，免疫组织化学在临床诊断和治疗中的应用(理解)，用于鉴定肿瘤的组织来源细胞受体癌基因、肿瘤抑制蛋白和生长因子的检测，对某些肿瘤的组织发生、发病机制、器官或组织特异性抗原标记物的再认识，前列腺标记物：PSA、PSAP、PSMA、P504s甲状腺标记物：TG、CT、TTF-1甲状旁腺：PTH黑素细胞标记物：MB45、S100，黑色素瘤肺腺癌标记物：TTF-1、SP-A和B，Napsin A肝细胞癌标记物：Hep-1乳腺：Mammaglobio，GCDFP15结肠：CDX2、B-连环蛋白宫颈癌更常见的临床情况：淋巴结或其他部位来源不明的转移性卵巢癌，疑似转移性膀胱腺癌、疑似侵袭性/转移性前列腺癌或有结肠癌病史的结肠癌患者的肺部有孤立结节：结肠癌转移或新