毛细管电泳芯片.ppt

1、毛细管电泳芯片，41113105钟超群2014/12，简介，近年来，以毛细管电泳为核心技术，以芯片为操作平台的芯片毛细管电泳技术迅速兴起， 在成为微型全化学分析系统(miniaturizedtotalchemicalanalysissystem )的几分钟或更短的时间内，可以同时分析数百个样品，这种快速的分析能力和分离过程的阵列化，可以得到极高的单位信息量芯片通常只消耗pL级的样品，可以在线实现样品的预处理和分析的全过程，这些特点都是芯片毛细管电泳在下一代毛细管电泳装置的研制中极为活跃的热点。 分析仪器的芯片化已尝试了气相色谱法，但该芯片装置无法实现商业生产，该尝试的主要成功之处是将微机械技术

2、引入分析化学领域。 90年代初，开始了芯片毛细管电泳动作模式的研究。 目前，对芯片上荧光标记的氨基酸、DNA限制性片段、PCR产物、短链寡核苷酸和测序片段等进行了分离分析研究。 基于半导体工业现有的微加工技术，采用光刻或微注射技术在芯片上制作用于样品和分离的微通道，是现阶段电泳芯片加工的常用方法。 毛细管电泳分离以电渗流为主要驱动力，通过电压切换实现液体流动、试样注入和分离，无需多馀的泵和阀门。 另一方面，由于光刻技术制作的电泳通道是自然连接，小到可以忽略系统整体的死体积，芯片的阵列化容易，潜在的廉价等理由，芯片毛细管电泳从90年代初开始迅速发展。 以下主要介绍芯片的加工技术、芯片中通道的设定

3、修正和毛细管电泳技术在芯片中的应用。 1 .芯片材料和加工技术2 .芯片结构3 .样品处理和诱导4 .检验方法5 .应用，1 .材料和加工技术，材料玻璃是目前使用最多的芯片材料，其成功应用主要与其所具有的良好光学性质、研究透彻的表面性质和微电子工业引入的成熟微加工技术有关最近，各种聚合物材料也备受瞩目，主要是因为聚合物芯片容易成形，制作成本较低。 另外，结晶硅、陶瓷、硅橡胶等材料也可以用于芯片毛细管电泳的制作，但硅的半导体性质不太适合高电场强度的电泳。 玻璃材料加工目前多采用标准光刻技术，主要包括膜沉积、光刻、蚀刻和粘结4个步骤。 膜的沉积：在玻璃表面喷涂金属掩膜，通常为Cr/Au，在金属掩膜

4、层上涂布光敏化剂。 光刻：用适当波长的光通过模板曝光芯片，用适当的蚀刻液去除曝光部分的光敏剂和金属掩模。 蚀刻：对芯片进行化学蚀刻，氢氟酸是最常用的蚀刻剂，可以通过控制温度来控制氢氟酸对玻璃的蚀刻速度，用轮廓曲线修正来监视整个蚀刻过程。 微通道蚀刻完成后，去除芯片表面残留的感光性物质膜和掩膜。 可以从芯片通道挖出与外部连接的缓冲液单元，钻到被蚀刻的基板上或其他空白的玻璃基板上。 粘接：通过接合蚀刻的芯片和另一空芯片，可以形成完整的芯片。 通常用加热的方法直接接合，将玻璃和硅加热到一定的温度，一般加热到五、六百度，使两个芯片之间的表面粘接，数小时到十小时后冷却。 聚合物芯片的制作技术与玻璃芯片有

5、很大区别，主要有激光烧蚀、注射模具、硅橡胶铸塑或模穴包括加工技术、2芯片结构、毛细管电泳芯片狭缝深度一般为10 40 m，宽度为60 200 m。近年来，毛细管电泳芯片的构造修订取得了显着进展。 最初的毛细管电泳芯片制作在表面积比较大的基板(14. 8 3. 9cm )上，微通道只有1条。 几年后，出现了包含2个交叉通道和4个缓冲池(分别是样品池、废液池、阳极、阴极池)的芯片。 Jacobson等人通过使分离通道弯曲成曲折状，增加了分离有效距离。 为了进一步增加分离距离，Manz等人设计了同步循环毛细管电泳芯片：通道为环形线，各边具有一对电极，通过变换电极间的电压，使分离物沿着环形线通道移动，

6、延长分离距离。 芯片上制作的微反应室可以在线实现样品的预处理和柱后诱导。 为了提高单位信息量，还产生了阵列毛细管电泳芯片。 具有多个分离通道的毛细管电泳芯片具有独特的设定修正要求，通常受底片的大小和检查等限制。 多通道微芯片的一种成功应用是基因分离型，该芯片具有48条平行分离通道，8分钟内可分离2组修正96个样本。 然而，目前被采用最多的是各种芯片，包括基于单个信道的线柱前导等。 3、样品的处理和诱导可以在毛细管电泳芯片上实现在线样品、样品的沉积浓缩及柱前柱后诱导等操作。 芯片毛细管电泳分离所需样品量小，通常为pL级。 芯片主要有两种试样注入结构，一种是由分离通路(两端分别与缓冲液罐和废液罐连

7、接)和试样注入通路(两端分别与试样罐和试样废液罐连接)构成的十字交叉结构，第二种是连接样品池的通道和废液池芯片毛细管电泳多采用电动样品，有时也极其个别地采用空气样品。 电动样品被分为栅极样品和收缩样品(pinched sample loading )。 收缩样品和栅极样品的最大区别在于，在前者的样品注入时，不是在分离通道的两端也浮游，而是通过施加电压，由于不同缓冲液单元的电差异效果，减少样品泄漏，降低能够减小频带扩展的检测界限，因此Jacobson 样品中的主要成分可能影响其中的微量成分分析，区域操作可以显着降低其影响。 区带操作可以改变分离中的样品的移动方向，用于片段收集和各种分析。 用停流

8、法收集碎片会导致样品的严重稀释。 在芯片分析中，收集到的片段可以通过电动控制从分离通道进入分支通道内，分离出的样品成分被稀释到大约4位以上。 自然界大部分物质本身没有荧光，为了进行激光诱导荧光(LIF )检查，通常需要对它们进行荧光标记。 标记可以在毛细管电泳分离前、柱后等柱前完成，标记检测分离的物质。 Jacobson等人为了实现柱前诱导，在芯片上制作了1 nL的微反应器。 通过对背景电解质、样品及试剂进行电动控制，可以实现通路内流体的精确控制。 关于柱后的样品诱导，可以通过在毛细管电泳分离通道的末端集成微反应器来实现。 反应器可能会引起大约10%的带宽。 4 .在检测系统、芯片毛细管电泳装

9、置中，由于检测单元的体积极小，且分离速度快，因此要求对检测系统的灵敏度和响应速度高。 目前使用最多的检测系统是激光诱导荧光(LIF )，常规的LIF检测器在共焦检测系统中可用于芯片检测。 LIF检测非常敏锐，可以达到单分子检测水平，但其应用范围有限，只有少数化合物可以被激光激发自身发出荧光，而且有限的几个激发波长与商品化的激光不一致，因此对分析物进行荧光标记后进行分析LIF成功地进行了基因分类多通道检测，发展成熟的LIF系统是芯片阵列毛细管电泳研究的重点之一。 可用于其他芯片的检测系统有质谱分析、电化学、拉曼光谱法和全息折射指数法等。 最初的芯片毛细管电泳和电喷雾离子化质谱(ESI/MS )并

10、用，只是利用芯片的电渗流将样品注入MS，没有分离的功能。 1999年Harrison等人首先实现了芯片毛细管电泳在线分离和电喷雾电离质谱(ESI/MS )的并用。 电化学检验因其小巧有利于芯片系统整体的微细化，近年来也倍受重视。 Wooly等人使用电化学检测系统分析DNA片段，为了减少分离高压的影响，作用电极位于离分离通道端口30 m的位置，对电泳分离后的物质进行柱外检测，该装置中限制片段的间接检测极限达到28 zmol。 另外，还尝试将拉曼光谱法和全息折射指数法用于芯片毛细管电泳的分离检查。 WaIker等人利用拉曼光谱法检测农药的芯片等速电泳分离，以8的分辨率、25光谱/s的速度进行数据收

11、集，以980拉曼光为内标，制备的标准试样浓度范围为mol/L。 Burggraf等人利用全息折射指数检测法分析了浓度为33 mmol/L的低聚糖，但检测极限差。 5、应用、核酸分析肽和蛋白质的其他应用、(1)核酸分析、芯片毛细管电泳的前沿应用领域之一是核酸分析，包括寡核苷酸、RNA、基因分类和DNA测序。 DNA的芯片毛细管电泳分析主要采用LIF检查，但电化学检查也有用。 迄今为止，芯片毛细管电泳对短寡核苷酸片段等DNA限制片段、RNA核糖体等进行了分离分析研究。 芯片毛细管电泳基因型分析是一个相当快速的发展领域，可以快速鉴定与各种遗传病相关的基因。 血色病(hemochromatosis )

12、、杜氏藻肌营养不良(Duchenne/beckermuscuiardystrophy )等。 Wooly等人于1997年利用芯片阵列毛细管电泳仪分析了来自HLA-H基因(遗传性血色病诊断相关基因)的限制片段，利用激光扫描法检测了噻唑黄(thiazole orange )标记12个样品最近，他们利用具有96个样品池和48个分离通道的芯片，在8分钟内完成了96个血色病样品的同时分析。 Jacobson等人对单硅玻璃芯片上有特殊部位缺失引起的杜氏藻肌营养不良症的多重PCR产物进行了分析。 以上工作表明毛细管电泳芯片在基因型鉴定领域具有很大的应用潜力。 阵列毛细管电泳芯片在DNA测序中的应用是研究的重

13、点，尤其是随着人类基因组工程的发展，受到了广泛的重视。 Mathies实验室首先于1995年开始了毛细管电泳芯片的DNA测序应用研究，以改性聚丙烯酰胺为筛分介质，以用能量转移染料标记的DNA片段为测序样品，有效分离长度为3.5 cm，10 15 min以内150 该实验室最近在具有96条径向分布的阵列毛细管电泳芯片上(其中各弯曲分离通道的有效长度为16 cm )，在25分钟内完成了4色M13标准DNA测序反应的分离，平均可读片段长度达到430 bp。 以上几项研究表明，芯片毛细管电泳在高速、高信息通量的DNA测序领域具有很大的应用前景。 以硅为材料制成的微PCR反应室可以集成在芯片上，制成集成

14、的DNA全分析系统。 微型PCR反应室具有快速的热循环特性，可在45分钟内完成沙门氏菌基因的扩增和分析。Jacobson等人在同一芯片上进行细胞分解、多重PCR扩增及电泳分离，在芯片上分解、扩增E. coIi细胞，得到PCR产物(bacteriophage，escherichia coli genomic DNA，and plasmid DNA ) 将复杂样品的预处理过程集成到几个芯片上完成，首先用一个芯片进行人体基因的非特异性扩增，然后将溶液转移到另一个芯片上，进行特殊部位杜氏藻肌营养不良症的多重PCR扩增反应，最后将扩增产物进行常规毛细管电泳和芯片毛细管电泳分析Burns等人在集成化硅片上

15、放大标记DNA后，以交联聚丙烯酰胺凝胶为介质，通过集成化芯片的加热器、温度传感器和荧光二极管在线检查样品流动，全过程只需4分钟。 (2)肽与蛋白质、蛋白质的分离是生命科学的重要组成部分。 最近有报告显示，用有效分离长度5 cm的SDS毛细管电泳芯片分离荧光标记蛋白(calmodulin，-latalbumin，pepsinogen，ovalbumin，BBS，and -galactosidase )。 在最佳优化条件下，搁板的高度为1，在以往的毛细管电泳中，搁板的高度为10。 在毛细管等的电聚焦在线检查中，要求通过区域带移动将蛋白质区域带带入检测器内。 Hoffmann等人可以用Cy 5标记肽

16、，在7 cm (长) 200 (宽) 10 (深)的通道内，聚焦于30 s以内，整个分析过程在5 min以下，最大峰容量约为30 40峰。 Mao等人采用了UV成像检查方法，分离通道的大小为4 cm 100 10，光路长度为10，肌细胞素的检查界限为2. 4 ng。 芯片毛细管区域的带电泳也可以进行蛋白质分析。 蛋白质混合物(albumin，-antitrypain，transferrin，and lgG )用2 toluidinonaphthalene6sulfonate标记后，位于芯片毛细管区的Chiem等人利用芯片毛细管电泳免疫法进行了单色用这种方法可以检测抗原抗体间的反应，修正平衡常数。 (3)其他应用，芯片毛细管电泳除了用于核酸、蛋白质的分析外，还可以分析其他化合物。 在传统的毛细管电泳和芯片毛细管电泳中，可以用免疫法分析低分子量的化合物。 将竞争机制导入免疫分析，测定血清样品中治疗哮喘用药物茶碱(theophyline )的浓度。 如果将未标记药物样本与含有已知数量的荧光标记的药物和药物抗体混合，未标记药物将与标记药物竞争，标记药物和抗体复合物的峰值信号降