2013.4丁芬—小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定.ppt

1、小容量注射剂药液微生物污染水平的测定及处理时间的限度确定，2013年1月，丁芬，一、概括二、试验目的三、试验方案四、试验结果及讨论五、污染菌鉴定六、注意事项、一、概括、无菌药品的生产中，防止微生物污染是生产企业关注的无菌是注射剂的主要质量要求按药典进行无菌检查是有限度的：污染率越低，相同取样量错误判断产品合格的概率越高；在相同污染率下，取样量越大，无菌实验结果提高了批量产品判断无菌的可靠性。 一、概括地说，对于污染率极低(如1% )的批量产品，即使增大采样数量，提高可靠性也是微乎其微的。 同时，过量的采样量也增加了实验过程的污染概率，影响了无菌实验结果的判断。 从无菌药品生产的各个环节分析微生

2、物污染存在的因素，有利于微生物污染控制，保证药品的无菌水平。 概要、药品生产质量管理规范(2010年修订)无菌药品附录第五十七条从药液配制开始到灭菌(或灭菌过滤)的间隔时间应尽量缩短。 必须根据产品的特性和贮藏条件建立相应的间隔时间控制标准。 二、试验的目的是在一定条件下，微生物随时间呈几何级数增长，“微生物污染水平监测”实质上也是时间间隔管理的实施方法。 我们通过对药液稀释配方后灭菌前生产过程不同时段药液中微生物的数量进行检测，确立微生物随时间的变化趋势关系，找到达到污染控制限度的时间点，确保一定的安全时间作为内部控制时限要求。 二、试验目的、无菌药品的灭菌与灭菌前产品的微生物污染程度有关，

3、检测控制灭菌前微生物污染状况是产品无菌评价的前提条件。 此次试验模拟生产品种： XX注射液，规格：5ml，生产批次： 12万支，充填时间：8h，灭菌： 6箱次。 二、试验目的除了微生物要求外，还应指出一些产品在溶液或其他状态下存在不稳定性，极易分解，产生新的杂质。 因此，基于药品化学稳定性的时间管理也是确定保管期限的制定依据。 三、试验方案，(一)设立试验组，明确由职责1、组成员：领导：质量负责人成员： QA、QC、注射剂厂2、职责2.1领导负责批准。 三、试验方案2.2 QA负责试验方案的起草和试验过程的采样和环境监测(全过程沉降菌和生产前后尘粒子、风速、温湿度的生产)。 负责协调工作，确保

4、按规定的项目顺利实施。 担任现场监督。 我负责数据和结果的审查。 三、试验方案、2.3 QC微生物检验实验准备和试验工作。 负责根据检验结果发放检验报告。 2.4注射剂厂负责指定作业人员和清洁人员。 负责按照生产工艺规程和操作SOP的操作。 三、试验方案、(二)确定风险点无菌检查不能保证最终灭菌产品的无菌状态。 成品无菌检查应视为确保无菌的一系列控制措施的最后措施。 因此，灭菌前产品的微生物控制应作为生产中最重要的质量保证措施和正常生产的前提条件。 三、试验方案，本公司XX小容量注射剂为最终灭菌制剂，5ml生产线的重要生产工艺为称量、浓配合、超滤、稀配合定容、过滤(微生物负荷过滤器)、除菌过滤

5、、填充、灭菌检漏。三、试验方案三、经试验方案、分析，可能影响成品无菌的要点是稀配液微生物污染水平，包括稀配液结束时的稀配液、填充完成过程的稀配液、填充即将结束前的稀配液在内的填充液的微生物污染水平是填充开始时的填充药液、填充过程的填充药液、填充即将结束前的填充药三、试验方案、(三)制定抽样修订本次试验修订计划模拟灌装时间为8小时，根据灌装机的灌装能力，确定生产批量为12万支，灭菌为6箱，按照xx注射液工艺规则组织生产。 对生产当天的注射用水进行微生物限度检查，监测生产环境：温度、湿度、尘埃粒子(生产前、生产过程、生产结束)、风速(生产前、生产结束)、沉降菌(生产全过程)、人员5指手套、皿表面微

6、生物(生产结束)每小时抽样检查微生物量的样品2 :除菌过滤前的药液， 即微生物负载过滤器过滤后的药液、从填充开始到填充结束，每1小时对微生物量进行采样检查的样品3、试验方案、样品3 :填充后的药品即除菌过滤后的药液、从填充开始到填充结束，每1小时进行采样检查即灭菌前的放置时间最长分别检测第一釜和最后一釜微生物量的样品5 :将应灭菌的药液放置1小时后，取出第一釜和最后一釜的应灭菌时间最长的药液，在灭菌程序启动后，进一步放置1小时后检测微生物量的三、试验案、三、试验案、二， 样品标签3 .标准及相关文件药品GMP指南无菌药品生产验证指南2003年版中华人民共和国药典2010年版XX注射液工艺规程，

7、三、根据试验方案，现代医药工业微生物实验室质量管理和验证技术4，取样器具取样瓶为250ml无菌玻璃磨口瓶三、试验方案、(四)检验方法采用薄膜过滤法进行药液微生物限度检验。 取过滤膜孔径0.45m、直径75mm的一次性全封闭薄膜过滤器(北京牛牛遗传基因技术有限公司，过滤器类型： NS01-75D1)，在过滤液槽台各插入一个过滤器，将其塑料软管放入集菌器的蠕动泵的管槽内，定位准确，软管势三、试验方案、其入液软管的双芯针插入供试液容器的插头中，打开集菌器，将供试液容器倒置，使药液均匀地通过过滤器，进行干净过滤。 打开滤膜菌面，贴于营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养。 每种培养基做一个过滤膜

8、。 细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，可每天观察菌落生长情况，计数菌落数，必要时将培养时间适当延长7天，修正菌落数，报告如下。 四、试验结果及研究；(一)微生物污染水平的检查结果参照下表、四、试验结果及研究，样品1 :稀薄配设罐内的稀薄配设液，稀薄配设后到生产结束，每1小时采样微生物量进行检查，微生物量随时间变化的趋势图如下研究： 0、0 第8小时分别用稀配罐取样进行微生物限度检查，第5小时以后开始检测微生物，数量为8cfu/100ml，随时增加微生物数量呈上升趋势。 生产即将结束时，检测药液的微生物数量为369cfu/100ml。 四、试验结果及研究表明，相当多的除菌过滤器的过滤效果验证表

9、明，理论上定容后的药液载菌量为6.01010cfu，(除菌过滤器至少达到107/cm2的过滤面积浓度的缺陷假单胞菌，过滤面积为0.6m2)为除菌过滤器的除菌我们的工艺验证规定微生物限度检查结果不足10cfu/ml。贫乏罐药液生产过程不同时间段的药液微生物数量的检测，可以把8小时作为贫乏罐药液污染控制界限的时间点。 四、试验结果及研究样品2 :除菌过滤前的药液，即微生物负荷过滤后的药液，从填充开始到填充结束，每1小时对微生物量进行抽样检查，微生物量随时间变化的趋势图如下：四、试验结果及研究、四、试验结果及研究生产即将结束时对药液进行检查四、试验结果及研究表明，我们通过检查除菌过滤前药液生产过程不

10、同时间段的微生物数量，8小时可以作为除菌过滤前药液污染控制限度的时间点，7小时可以作为预约的安全时间，作为内部控制时限的要求。 四、试验结果及研究样品3 :填充后的药品，即除菌过滤后的药液，从填充开始到填充结束，每1小时对微生物量进行抽样检查，微生物量随时间变化的趋势图如下：四、试验结果及研究、四、试验结果及研究、研究：第0生产即将结束前将药液相当于灭菌前的药液100 cfu/100ml的微生物数量。 四、试验结果及讨论，我们通过检验填充药液生产过程不同时段的微生物数量，可以将8小时作为填充药液污染控制限度的时间点，将6小时作为预约的安全时间作为内部控制时限的要求。 四、试验结果及研究样品4

11、:灭菌前药液，即灭菌前放置时间最长的药液，第一锅灭菌前药液微生物数为0，第六锅灭菌前药液微生物数为37 cfu/100ml，与100 cfu/100ml灭菌前药液的微生物数一致。 四、试验结果及研究，样品5 :将要灭菌的药液放置1小时后，取出第一锅和最后一锅灭菌时间最长的药液，灭菌程序启动后再放置1小时后检查微生物量，第一锅灭菌时间放置1小时后的微生物数为3 cfu/100ml， 第六锅灭菌时间放置后的微生物数为118 cfu/100ml，四、与试验结果讨论，我们通过检查灭菌前的药液和将灭菌的药液放置1小时后的药液的微生物数，能够使9小时成为能够稀薄地分配到灭菌污染控制限度的时刻，将预约了7小

12、时的安全时间作为内部控制时限四、试验结果和讨论、污染控制限度的时间点和内部控制时限的总结表；四、试验结果和讨论、确定微生物污染内部控制的时限：稀薄到充填结束时限为6小时，从充填开始到灭菌结束时限为7小时，每次最长等待灭菌时限为3小时。 四、试验结果及讨论；(二)其他检验结果生产当天注射用水微生物限度检验结果为0，标准10 cfu/100ml，符合规定。 填充间生产环境：温度、湿度、尘埃颗粒(生产前、生产过程、生产结束)、风速(生产前、生产结束)、沉降菌(生产全过程)、人员5指手套，接触(生产结束)盘表面微生物的结果均符合规定。 四、试验结果及讨论；(三)最终成品检验情况成品按照灭菌柜检验无菌和

13、热原，结果均符合规定。五、污染菌鉴定、微生物鉴定程序(见现代医药工业微生物实验室质量管理和验证技术P205 ) (一)原则微生物鉴定遵循逐步缩小范围的原则，采用细菌分类学知识和操作程序，逐步对科、属逐步执行未知微生物，并选择相应的数字鉴定系统对未知微生物进行种五、污染菌的鉴定、鉴定包括以下环节： 1、菌株采集2 .菌株纯化； 3 .菌落形态学观察如形状、大小、颜色4 .细胞形态观察如球状、棒状、螺旋状、弧状、丝状及其排列方式5 .革兰氏染色反应、阳性或阴性； 6 .氧化和发酵试验7 .接触酶和氧化酶试验； 8 .鞭毛和动力等。 五、污染菌鉴定通过上述基础实验结果结合细菌鉴定检索表确定微生物所属

14、范围，选择适当的数值分类鉴别试验条件(API试验条件)对微生物进行种类鉴定。 五、污染菌鉴定、五、污染菌鉴定、细菌鉴定检索表包括细菌鉴定的基本定向生化鉴别试验，通过这些定向生化试验可以选择适合大多数未知菌鉴定的API试纸。 五、污染菌的鉴定，如何根据该鉴定表选择使用方法的步骤： 1、纯化、分离鉴定对象菌的无菌操作用接种环，采集鉴定对象菌落，或将含有少许菌的溶液刻划分离为对应的培养基(例如TSA )，单菌的菌种2 .选择精制后的单菌落进行革兰氏染色、镜检，确定鉴定对象菌的革兰氏属性。 五、污染菌鉴定三、镜检结果为革兰阴性杆菌，先进行发酵实验。 发酵实验结果阴性，用API20NE试剂条进行鉴定。

15、发酵实验结果为阳性，经细胞色素氧化酶实验后，用API20E试剂棒进行鉴定。 4 .如果镜检结果为革兰氏阳性球菌，先进行过氧化氢酶实验。 如果实验结果为阴性，就用API Strep试剂条进行鉴定，如果实验结果为阳性，就用API Staph试剂条进行鉴定。 五、污染菌鉴定、五、果镜检查结果为革兰氏阳性杆菌，有内生芽胞时，用API 50CHB试剂条件鉴定。 否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果，用API Coryne或其他试剂条件进行了鉴定。 6、表中未记载的其他试剂条件API 20A试剂条件可用于厌氧菌的鉴定。 API 20C AUX试剂条件可用于酵母菌的鉴定。 五、污染菌鉴定、7、选择正确的

16、试剂条件后，根据不同API试剂条件的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作将结果数字化，用API鉴定软件鉴定或查询检测菌的名称即可。 鉴定结果记录，必要时给予相应的解释。 五、污染菌鉴定、(三)革兰氏染色试验细菌鉴定过程中首先需要完成的一些实验称为基本取向生化试验。 介绍革兰氏染色实验的原理、操作程序和试剂制备的内容。 五、污染菌鉴定，1、原理是革兰氏阳性细菌的细胞壁厚，细胞壁中肽聚葡萄糖含量高，网格结构密，脂质含量低，如果用结晶紫复合溶液对细胞染色后用脱色剂脱色，细胞壁肽聚葡萄糖的网格结构孔径缩小后封闭，阻止结晶紫碘复合物的逸出菌体呈深紫色五，污染菌鉴定，革兰氏阴性细菌细胞壁中肽聚糖含

17、量低，脂含量高，用酒精脱色后脂质物质溶解，细胞壁渗透性增大，结晶紫碘复合体被提取，菌体呈复染液红色。 五、污染菌鉴定、二、染色液的制备2.1结晶紫染色液将a液(结晶紫2.0g溶解于20ml95%乙醇)和b液(草酸铵0.8g溶解于80ml蒸馏水)混合，静置48小时后进行过滤。 五、污染菌鉴定，取2.2卢戈碘液，碘化钾2.0g溶于蒸馏水5ml，再加碘片1.0g，碘全部溶解后，蒸馏水可加入300ml。 也可以只加入蒸馏水至100ml，配制母液储藏，使用时加倍蒸馏水。 2.3脱色液95%乙醇溶液。五、污染菌鉴定，2.4复染液(0.25%的砂黄液)取砂黄0.25g溶于95%乙醇10ml中，完全溶解后加入蒸馏水至100ml。 3制薄板，染色操作在干净的载玻片上滴下蒸馏水或生理盐水，将少量菌龄18-24小时的菌苔和水滴用接种环充分涂布混合，采集1cmX1cm大小的区域中混入的菌膜，在自然干燥或酒精灯火焰上进行低烧干燥，多次通过火焰上固定涂膜。