林谦第7章RNA的生物合成.ppt

1、分子生物学,玉林师范学院生命科学与技术学院 林谦 2013.9.,第7章 RNA的生物合成 DNA是生物最重要的遗传物质，其贮存信息的方式是它的一级结构，蛋白质是生物体功能的主要执行者，其功能由特定的三维结构决定，但蛋白质的三维结构归根到底也是由其一级结构决定。要将DNA的一级结构转化为蛋白质的一级结构，首先需要按照碱基互补配对的原理，以DNA为模板，RNA，然后再以RNA为模板，合成蛋白质。这种以RNA为模板合成RNA的过程称为转录，以RNA为模板合成蛋白质的过程称为翻译或转译。转录和翻译统称为基因表达。,7.1 DNA转录 7.1.1 转录的一般特征 (1) 转录发生在DNA分子上某些特定

2、的区域 转录只发生在DNA分子上具有转录活性的区域，DNA两条链并不是总会被转录。对某一特定基因来说，作为模板的DNA链称为模板链、无义链、Waston链，与模板链互补的另一条链称为编码链、有义链、Crick链。,图7-1 DNA转录的简单图解,(2) 以NTP作为底物，需要Mg2+的激活。 (3) 需要模板，需要DNA解链，但不需要引物。 (4) 第一个被转录的核苷酸通常是嘌呤核苷酸。 (5) 转录的方向总是53。 (6) 转录具有高度的忠实性，但低于DNA复制。 (7) 转录受到严格调控，主要发生在转录起始阶段。,复制和转录的共同点:,DNA 模板 碱基配对规律 生成磷酸二酯键 链延长方向

3、53,A,-,U,，,T,-,A,，,G,-,C,A,-,T,，,G,-,C,配对,mRNA,，,tRNA,，,rRNA,子代双链DNA,(半保留复制),产物,A,-,U,，,T,-,A,，,G,-,C,A,-,T,，,G,-,C,配对,mRNA,，,tRNA,，,rRNA,产物,RNA聚合酶,DNA聚合酶,酶,NTP,dNTP,原料,模板链转录(不对称转录),两股链均复制,模板,转录,复制,需要引物,不需要引物,复制和转录的不同点:,在RNA聚合酶的催化作用下，以DNA为模板，四种核糖核苷三磷酸(NTPs)为原料合成RNA的过程。,转录(Transcription),转录过程中碱基配对差异：

4、,模板链(template strand)：在转录过程中直接参与指导RNA合成过程的DNA链，其序列与新合成的RNA链互补。 编码链(coding strand)：在RNA合成过程中不直接参与指导RNA合成的DNA链，其序列与新合成的RNA链对应。,高度的忠实性(high fidelity): 转录的忠实性是指一个特定基因的转录具有固定的起点和固定的终点，而且被转录产生的剪基序列，严格遵守碱基互补原则。 然而，转录出错率高于复制出错率。 因为RNA聚合酶没有校读功能。,高度的进行性(highly progressive): 正常的转录一旦发生，就不会中途停止，转录终止前RNA聚合酶不从模板链解

5、离下来。 一旦RNA聚合酶从模板链解离，则解离下来的酶不可能与解离点重新结合。,调控区： 调控转录的区域不在转录产物的序列中，而是在转录开始位点的上游。 复制调控的区域在复制产物序列中。,不对称转录,(asymmetric transcription),* 在DNA分子双链上某一区段，一股链可转录，另一股链不转录；,* 模板链并非永远在同一单链上。,模板链,结构基因,模板链,编码链,编码链,模板链,不对称转录,转录单位：一个转录区段可视为一个转录单位(操纵子，包括 若干个结构基因及其上游的调控序列。,+1,转录起点,编码区(开放阅读框),转录终点,启动子,终止子,转录单位,7.1.2 DNA转

6、录的酶学 转录主要由RNA聚合酶催化。RAN聚合酶的三维结构高度保守。细菌、古细菌和真核生物细胞核和叶绿体的RNA聚合酶由多个亚基组成；噬菌体和线粒体基因组编码的RNA聚合酶只有1个亚基。 所有的多亚基RNA聚合酶都有5个核心亚基，细菌还有一个专门识别启动子的 因子。,7.1.2.1 RNA聚合酶与DNA聚合酶的性质比较 RNA聚合酶催化的反应为：,7.1.2.2. 原核细胞RNA聚合酶的结构与功能 7.1.2.2.1 细菌的RNA聚合酶,核心酶(core enzyme)： 全酶(holoenzyme)：,图7-2 E. coli RNA pol的体外组装,大肠杆菌RNA聚合酶各亚基的性质与功

7、能,细菌的RNA聚合酶都受到利福霉素和利链霉素的特异性抑制，这两种抑制剂作用的对象都是 亚基。利福霉素抑制转录的起始，阻止第三、四个核苷酸的掺入，利链霉素与聚合酶结合，抑制延伸。 这两种抑制剂不抑制真核生物细胞核的RNA聚合酶，但对线粒体和叶绿体内的RNA聚合酶有明显的抑制作用。,7.1.2.2.2 古细菌的RNA聚合酶 在结构和组成上，古细菌的RNA聚合酶与真核生物的更像，而非细菌的RNA聚合酶。 7.1.2.3 真核细胞的RNA聚合酶 真核细胞的RNA聚合酶在功能上有分工，不同性质的RNA分子由不同的RNA聚合酶催化合成。 细胞核有三种RNA聚合酶。线粒体和叶绿体也有RNA聚合酶，负责两种

8、细胞器内所有RNA分子的合成。 真核细胞RNA聚合酶自己不能直接识别启动子，必须借助于转录因子才能结合到启动子上。,真核细胞RNA聚合酶的种类,细菌的RNA聚合酶受到利福霉素和利链霉素的抑制，但这两种抑制剂不抑制真核生物细胞核的RNA聚合酶。 真核生物细胞核RNA聚合酶对 鹅膏蕈碱表现出不同程度的敏感性。 利用 鹅膏蕈碱对三种RNA聚合酶的选择性抑制可判断细胞内的某一种RNA由哪一种聚合酶转录。 放线菌素D能插入到DNA的GC碱基对之间，导致DNA双螺旋小沟变宽和扭曲，阻止转录延伸。rDNA的GC含量最高，因此，RNA聚合酶I对放线菌素D的作用最敏感。,图7-3 鹅膏蕈碱的化学结构,图7-4

9、放线菌素D的化学结构,7.1.3 原核生物的DNA转录 转录可分为三阶段：起始、延伸和终止。 7.1.3.1 转录的起始 7.1.3.1.1 转录起始点 启动子是位于结构基因5端上游的一段DNA序列，可被RNA聚合酶识别并结合，以启动基因转录。 一般在转录起始点的上游存在转录启动子序列，它们具有高度的保守性。,原核生物启动子,10 Box：也称为Pribnow盒，一致序列为TATAAT，有利于转录时双链的解开。 35 Box：一致序列为TTGACA，提供聚合酶结合时的识别位点。 -35区域的核苷酸结构决定了启动子的强度。,图7-9 原核生物几种基因的启动子序列,图7-10 细菌RNA pol全

10、酶与启动子的结合,某些活性超强的基因(rRNA基因)除了-35区和-10区的启动子序列，在-40和-60之间的区域还有一种称为增强元件的启动子序列，可将转录活性提高30倍。,启动子的一致序列是综合统计了多种基因的启动子序列后得出的结果。在大肠杆菌尚未发现与一致序列完全相同的启动子序列。 一个基因的启动子序列与一致序列越接近，该启动子的启动效率就越高，为强启动子；相反，一个基因的启动子序列与一致序列差异越大，启动效率就越低，为弱启动子。,7.1.3.1.2 转录起始复合物的形成 转录起始复合物的形成为DNA转录的限速步骤，起始效率主要由启动子强度决定：强启动子平均每秒钟启动一次，弱启动子花费的时

11、间长得多。一旦启动，RNA链延伸的速度与启动子强度无关。,图7-11 细菌基因转录起始过程中开放复合物的形成,RNA聚合酶与模板DNA的结合,RNA合成的起始,起始位点的嘌呤碱基与模板+1位碱基配对,图7-12 基因转录起始过程中第一个磷酸二酯键的形成,开放复合物内的RNA聚合酶往往会重复催化短RNA分子的合成并释放它们，这样的合成称为“无效”合成。聚合酶的活性中心最多能容纳8 nt，差不多等于“无效”转录物的长度。 每合成一个“无效”转录物，聚合酶必须决定是离开启动子，进入延伸阶段，还是仍然结合在启动子上，重新启动RNA的从头合成。 一旦新生的RNA结合到酶的第二个RNA结合位点，酶的催化中

12、心被“重新设定”，能够催化合成7 nt12 nt的RNA。,启动子清空指聚合酶离开启动子以实现转录从起始进入延伸的过程。 RNA聚合酶在合成前9个核苷酸的时候并没有在DNA上移位。当转录物长度达到一种稳定的RNA-DNA杂交双链的时候，启动子清空才开始发生。 因子使聚合酶对启动子有高亲和性， 因子一旦解离，核心酶就与非特异性DNA以一般的亲和性结合，这非常适合转录延伸。为防止 因子与延伸复合物中的核心酶重新结合，一种新的蛋白质NusA作为延伸因子代替 因子与核心酶结合。,图7-13 细菌基因转录从起始阶段向延伸阶段的转变,7.1.3.1.3 RNA聚合酶的移位和转录的延伸 当RNA聚合酶合成了

13、大约10 nt的RNA，延伸便开始。此时转录物的长度足以让RNA取代 因子。 释放出来的 因子可重新与核心酶结合，再次启动新一轮DNA的转录，称为RNA聚合酶的循环。 当 因子释放后，延伸因子NusA蛋白加入进来，转录进入延伸阶段。 在延伸过程中，RNA聚合酶不断移位，转录新的模板链序列。,图7-14 RNA pol的循环,因子的脱落，促进了RNA合成速度提高到约50核苷酸/秒分子酶。,图7-15 转录的延伸和转录泡的结构,图7-16 RNA pol的移位反应,图7-18 转录过程中发生的各种事件,原核系统转录终止的主要方式，也称为简单终止。依赖于位于RNA转录物3-端的一串U序列，以及位于紧

14、靠U序列上游的一个富含GC碱基对的发夹结构。,7.1.3.1.5 转录终止,(1) 不依赖 因子的终止,图7-20 不依赖因子的转录终止子结构,(2) 依赖 因子的终止,因子( factor)：由50kD亚基组成的六聚体，是一种ATP依赖型解链酶，可解开RNA/DNA和RNA/RNA双链。,图7-22 因子与转录物的结合,图7-23 依赖因子的转录终止,7.1.4 真核生物的DNA转录 7.1.4.1 真核生物DNA转录与细菌DNA转录的主要差别 (1) 染色质和核小体结构对转录有深刻影响 (2) 真核生物的RNA聚合酶与细菌有许多重要的差别 (3) 转录的正常进行，除了需要RNA聚合酶外，还

15、需要许多转录因子的参与。 (4) 启动子以外的序列参与调节基因的转录。 (5) 转录与翻译不存在偶联关系。 (6) 转录的产物多为单顺反子，而原核生物的基因转录产物为多顺反子。,真核生物启动子由转录因子识别。 蛋白辅助因子 转录因子 TF-I RNA pol I TF-II RNA pol II TF-III RNA pol III 转录因子(transcription factor,TF)：能直接或间接与结构基因上游的调控序列(DNA序列)或RNA聚合酶结合，影响转录的蛋白质因子。 某些转录因子是三种RNA聚合酶共有的，如TBP，另一些转录因子则是各RNA聚合酶特有的。,真核生物包括三类启动

16、子：,7.1.4.2 真核细胞核DNA转录的起始、延伸和终止 7.1.4.2.1 RNA聚合酶I催化的转录 RNA聚合酶I负责催化28S rRNA、18S rRNA和5.8S rRNA的转录，转录场所为核仁。这三种rRNA共用一个启动子，含有多个拷贝。45S rRNA是它们的共同前体，通过转录后加工分别得到各自的产物。,图7-24 rRNA基因的结构和组织,RNA聚合酶I转录的基因启动子由两部分组成：核心启动子，是转录所必需的，与基因的基础转录有关；上游控制元件(UCE)，是基因的有关转录所必需的。 RNA聚合酶I需要两种转录因子：UBF(UCE结合因子)、SL1。SL1包含TBP(TATA盒

17、结合蛋白)和TAF(TBP相关因子)两种成分。 TBP是三种RNA聚合酶催化的转录所必需的蛋白质。,7.1.4.2.2 RNA聚合酶III催化的转录 RNA聚合酶III负责催化tRNA、5S rRNA、7SL RNA、小分子核仁RNA(SnoRNA)、无帽子结构的小分子细胞核RNA(SnRNA)和某些病毒的mRNA等。 RNA聚合酶III转录的基因启动子有两类：一类位于基因的上游，属于外部启动子；另一类位于基因内部，被称为内部启动子。 RNA聚合酶III需要的转录因子有三种：TF III A、B、C。,图7-26 RNA polIII催化转录的基因的启动子结构,7.1.4.2.3 RNA聚合酶

18、II催化的转录 RNA聚合酶II负责催化mRNA、具有帽子结构的snRNA和某些病毒RNA的转录。 蛋白质基因的转录受到各种顺式作用元件的控制，包括核心启动子、调控元件、增强子和沉默子。 顺式作用元件：某些具有调节功能的特定DNA序列只能影响同一分子中的相关基因，发生在一个序列中的突变不会改变其他染色体上等位基因的表达，这样的序列称为顺式作用元件。顺式作用元件一般没有转录产物。 反式作用因子：某些调节蛋白通过扩散结合于细胞内的多个靶位点，发生突变后将同时影响不同染色体上等位基因的表达，这样的蛋白称为反式作用因子。,核心启动子 也称基础启动子，参与招募和定位RNA聚合酶II到转录起始点，从而正确

19、地启动基因转录。包含下列元件： TATA盒 起始子(Initiator, Inr) TF II B识别元件(BRE) 下游启动子元件(DPE) GC盒,调控元件 包括上游临近元件(UPE)和上游诱导元件(UIE)。 增强子和沉默子 增强子是一种能大幅度提高基因转录效率的顺式作用元件。可远距离作用(可大于几个kb)； 位于启动子上游或下游都可发挥作用；可在模板链上或也可位于编码链上；功能与序列方向性无关；具有组织特异性。 沉默子是一种抑制基因表达的顺式作用元件。,图7-28 RNA polII负责转录的基因的启动子结构特征,参与蛋白质基因转录的转录因子有两类：一类是基础转录因子或基础转录因子(G

20、TF)，另一类为特异性转录因子。前一类为所有蛋白质基因表达所必需，后一类为特定的基因表达所必需。 基础转录因子的功能包括：识别和结合核心启动子，招募RNA聚合酶II，正确地与启动子结合；与其他上游元件或反式作用因子结合或相互作用；参与蛋白质与蛋白质的相互作用，有助于转录起始复合物的装配和稳定。基础转录因子包括TF II A、B、C、C、E、F、H、J等。,7.2 RNA复制 RNA复制是以RNA为模板合成RNA的过程，发生在许多RNA病毒的生活史中，由依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRP，也称RNA复制酶)催化。 RdRP在正常宿主细胞中并不存在，必须由病毒基因组编码。,RNA复制具有以下特征： (1) 复制的方向为53； (2) 绝大多数在模板的一端从头合成，少数需要引物。引物为共价结合的蛋白质或5-帽子； (3) 属于易错、高突变的RNA合成； (4) 对放线菌素D一般不敏感，但对核糖核酸酶敏感； (5) 复制绝大多数发生在宿