NK, DC和Mφ的分离.ppt

1、NK, DC和M的分离和功能检测,董薇 ,第一节 NK细胞的分离和功能检测,NK细胞:natural killer cells,自然杀伤细胞, 含有大量嗜天青颗粒,大颗粒淋巴细胞 自然杀伤:不需要抗原预先激活,也不需要抗体参加,就能直接杀伤MHC-I类分子表达缺失或低表达的靶细胞(病毒感染和肿瘤细胞),一. NK细胞的表面标志及其鉴定,1.CD56,CD16,CD161,CD94,KIR等 2.多种细胞因子受体:IL-2R,IL-15R 3.多种黏附分子,4.受体 抑制性受体:识别自身MHC-I类分子,病毒感染细胞或肿瘤细胞不表达或低表达 激活性受体:配体不明确,1)抑制性受体:胞浆中含有IT

2、IM基序 杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)家族:胞外段含有Ig样结构域 免疫球蛋白样转录体(ILT)家族:结构上也含有Ig样结构域 杀伤凝集素样受体(KLR)家族:由一个C-型凝集素与CD94共价结合构成的异源二聚体,2)激活性受体:与之相连的信号分子均有ITAM基序. CD16:ADCC作用 人自然细胞毒受体(NCR):特异性表达在NK细胞表面 MHC特异性受体:连接含ITAM结构的辅助分子,传递活化信号给NK.能识别正常的MHC-I类分子,但亲和力比较低.,NK细胞效应机制:抗病毒、抗肿瘤 （1）胞毒效应：ADCC, 穿孔素和颗粒酶；Fas/FasL途径 （2）分泌细胞因子：IFN-或、IF

3、N-、TNF-、GM-CSF、M-CSF等多种细胞因子,ADCC,5.表面标志的鉴定,免疫荧光技术:荧光抗体染色(直接法,间接法,双标法) 免疫微粒技术:单抗连接微粒形成免疫微粒 流式细胞术,间接免疫荧光法,荧光显微镜检测：淋巴细胞+相应单抗 荧光素标记的二抗 观察,二.NK细胞的分离方法,一.外周血非黏附单个核细胞分离法 人血液中各种细胞的密度如下： 红细胞：1.0901.110 淋巴细胞:1.0521.077 单核细胞：1.0501.066 血小板：1.0301.060 单个核细胞包括：淋巴细胞和单核细胞,1.分离外周血单个核细胞PBMC 1)Ficoll 分离法分离PBMC,分离介质：F

4、icoll-Hypaque(淋巴细胞分离液) 原 理：Ficoll-Hypaque密度： 1.0770.001 主要材料： 淋巴细胞分离液 RPMI1640培养液 离心管等 肝素抗凝血,Ficoll-Hypaque混合液:主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心分离法。其主要成分为聚蔗糖(商品名为Ficoll )。可将血液分成四层，从上到下依次是：血浆、单个核细胞、粒细胞和红细胞。,Ficoll 分离法分离PBMC,2) Percoll分层液分离PBMC 是一种连续密度梯度离心分离法，其主要成分为硅胶颗粒，其原液密度为：1.135。可将血液分成四层，从上到下依次是：死亡细胞

5、和血小板、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞和红细胞。,2.去除单核细胞:黏附去除法 单核细胞具有黏附塑料和玻璃表面的特性,而淋巴细胞没有.,3.去除B细胞:尼龙棉柱法 将淋巴细胞悬液加入尼龙棉柱内，B细胞易粘附于尼龙棉纤维(聚酰胺纤维)表面，而T细胞则不易粘附，由此可将T细胞与B细胞分离。 该法简便易行，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，所获T细胞纯度可达90%以上，B细胞纯度可达80%。,4.去除T细胞:花环形成分离法 成熟的T细胞表面表达绵羊红细胞(SRBC)受体，即E受体。T细胞能与SRBC结合形成E花环，而B细胞则不能。 该方法简便易行，所获细胞的纯度可达95%99%，可同时获得B细胞。缺

6、点是E花环形成后可能使T细胞活化。,5.收集NK细胞 剩余的淋巴细胞就是NK细胞.,二.免疫吸附法 抗NK细胞表面分化抗原的抗体包被在平皿或培养板上,进行阳性分选(正选)和阴性分选(负选),间接免疫吸附法分离NK细胞 羊抗小鼠Ig(二抗)包被平皿或培养板,抗T细胞特征性分化抗原的抗体(一抗)结合T细胞,单核细胞和B细胞具有黏附特性,未结合,未黏附的淋巴细胞就是NK细胞.,二抗+一抗 T细胞 B,单核 黏附 剩余的就是NK细胞,三.柱亲和层析法 生物素标记NK细胞特异性单抗+PBMC 共同孵育,再通过亲和素-生物素凝胶柱,与柱结合的细胞就是所需NK细胞. 亲和素有4个与生物素结合的位点, 两者结

7、合的亲和力比抗原抗体强100万倍,四.免疫磁珠(IMB)分离法 直接法:抗某种细胞特异性的抗体结合到磁珠上,形成免疫磁珠,与混合淋巴细胞悬液孵育后,利用磁力作用,与IMB结合的靶细胞沉降,再解离靶细胞和IMB.,间接法:羊抗鼠二抗结合IMB,针对要去除的细胞表面特异性抗原的一抗,预先和混合淋巴细胞孵育,利用磁力作用,与IMB结合的细胞弃去,未结合的细胞即为所需细胞. 阴性分选,免 疫 磁 珠 细 胞 分 选 装 置,五.微量细胞毒分离法: 特异性抗体结合细胞表面抗原后,在补体存在下,抗原与抗体结合的细胞被溶解,从而去掉无关细胞,获得目的细胞. 六.流式细胞术,三.NK细胞功能检测,对病毒感染细

8、胞的杀伤:穿孔素,颗粒酶,NK细胞毒因子,TNF,Fas,TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL) ADCC 免疫调节,采用检测NK细胞活性来研究NK细胞的功能 靶细胞为K562(人),YAC-1(小鼠) 效应细胞为PBMC或小鼠脾细胞,一.形态学法,二.放射性核素释放法 51Cr释放法: Na251CrO4能进入到增殖的细胞内，与细胞浆蛋白质牢固地结合。当标记的51Cr细胞受到损伤或死亡之后，即可释放出51Cr。51Cr辐射射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中的51Cr，即可计算出NK细胞活性。,125I-UdR释放法: 125I-UdR （125I-2-脱氧尿嘧啶核苷）是胸腺嘧啶核苷

9、的类似物，作为DNA合成的前体物，能相当特异地取代胸腺嘧啶核苷掺入到细胞核DNA链上。 用125I-UdR标记体外传代培养的肿瘤细胞作为靶细胞，以外周血分离的单个核细胞或小鼠脾细胞作为效应细胞，进行体外NK细胞活性检测。 被效应细胞杀伤的靶细胞溶解后可释放125I-UdR，用-计数仪测定其放射性强度，以125I-UdR释放百分率表示NK细胞的活性。,三.乳酸脱氢酶LDH释放法 活细胞的胞浆内含有LDH。正常情况下，LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK细胞的杀伤后，LDH释放到细胞外。LDH 可使乳酸锂脱氢，进而使NAD还原成NADH，后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化四氮唑

10、（INT），INT 接受H被还原成紫红色formazan。在490nm或570nm波长处有一高吸收峰，利用读取的OD值，经过计算即可得知NK细胞活性。,NK细胞活性（%）反应孔OD自然释放孔OD 最大释放孔OD自然释放孔OD 100%,注意事项 1、靶细胞和效应细胞必须新鲜，细胞存活率应大于95。 2、比色时环境温度应保持恒定。 3、LDH基质液应临用前配制。 4、在一定范围内，NK细胞活性与效靶比值成正比。一般效靶比值不应超过100。,四.MTT比色法 四甲基偶氮唑盐(MTT)可被活细胞中的琥珀酸脱氢酶还原成深蓝色化合物formazan, formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死

11、细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）.还原生成的formazan结晶可以用DMSO来溶解 ,选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果 .,五.流式细胞术 碘化丙啶(PI)只能渗透到死细胞内,而活细胞排斥PI,加上NK细胞体积和光散射特性和靶细胞不同,利用FCM分选出靶细胞群,靶细胞死亡率就是NK细胞活性.,第二节 DC的分离和功能检测,树突状细胞(dendritic cell,DC) 功能最强的APC 能活化初始T细胞的主要APC 分布广泛,但数量只占外周血单个核细胞的不到1% 正常情况下,以未成熟状态存在,功能为摄取加工抗原 只有经过细胞因子等的刺激后功能成熟,

12、以提呈抗原为主要功能.,来源,GM-CSF TNF-a IL-4,按照组织分布分类,1）淋巴样组织中的DC 并指状DC (interdigitating cell，IDC)： 外周淋巴组织的胸腺依赖区，是淋巴组织胸腺依赖区的重要APC，其表面缺乏IgR和C3bR，但富含MHC-I,II类抗原 滤泡样DC (follicular DC，FDC)：淋巴滤泡生发中心，表面有FcR和C3bR，能有效地捕捉复合形式的抗原，并将抗原长期保留在其表面，以维持二级滤泡的记忆功能; 胸腺DC (thymic DC，TDC ) ：胸腺髓质,IDC,FDC,2）非淋巴样组织中的DC 郎罕细胞（Langerhans

13、cell）:位于皮肤和胃肠上皮层，是这些部位的重要APC，其表面有丰富的MHC-I,II类抗原以及FcR和CbR，胞浆内有birbeck颗粒 间质性DC （interstitial DC）: 心肺肾肝胃间质 3）体液中的DC 隐蔽DC （veiled cell）：输入淋巴液 血液DC （peripheral blood DC）：外周血,皮肤淋巴管中的LC,骨髓DC前体,血流,非淋巴组织,分化,非成熟DC,定居,上皮组织、胃肠道、生殖道和 泌尿管道、气道以及实质脏器的间质,具有很强的摄取、处理和加工 抗原的能力，但提呈抗原能力弱,细胞因子和抗原刺激下,DC细胞成熟并迁移进入局部淋巴结,摄取、处理

14、和加工抗原的能力变弱 ，但提呈抗原能力逐渐增强,树突状细胞的分化、发育与迁移,DC的生物学功能 1、提呈抗原,皮肤中的郎罕细胞在摄取抗原后通过淋巴循环进入淋巴结，并逐渐成熟，高表达MHC-类分子及共刺激分子，活化初始T细胞。,2、参与T细胞分化成熟,外周淋巴器官细胞依赖区的FDC不表达MHC-II类分子,而表达大量的FcR和CR,这些受体可结合免疫复合物但不发生内吞,免疫复合物可在FDC表面长期保存，并向B细胞提供抗原信号及共刺激信号,诱导Ig类别转换,亲和力成熟和免疫记忆。 DC还通过诱导Th细胞活化间接激活B细胞.,3、参与细胞发育、分化及激活,DC可分泌多种细胞因子,调节免疫功能。 人D

15、C：IL-1、IL-1、IL-8、INF-、 TNF-和GM-CSF等； 小鼠DC：可分泌IL-6和IL-12等。 DC还可分泌多种趋化因子，介导其他免疫细胞的趋化作用。,4、免 疫 调 节,5、参与免疫耐受: 未成熟DC可诱导外周免疫耐受 不表达共刺激分子,不能激活T细胞,诱导T细胞失能,引起自身耐受; 诱生调节性T细胞,分泌IL-10,TGF-,抑制T细胞应答,促进外周耐受形成; 胸腺DC参与胸腺内T细胞的阴性选择,清除自身反应性T细胞，参与T细胞的中枢耐受.,一.DC的分离 1.单核细胞诱导培养DC 先分离PBMC,再利用单核细胞贴壁而淋巴细胞不贴壁的特性,获得单核细胞,或者以免疫磁珠法

16、去除T,B细胞,收获单核细胞. 单核细胞加GM-CSF+IL-4+TNF-诱导转化形成DC,GM-CSF:维持DC发育及分化 IL-4:抑制培养物中粒细胞和巨噬细胞的形成,并维持DC处于未成熟状态 TNF-:抑制粒细胞产生,促进DC成熟. 每隔3天半量换液,维持细胞因子浓度,在培养的day7加入TNF-诱导DC成熟,至培养的day12,收获细胞.,2.CD34+细胞诱导扩增DC CD34+造血干细胞具有自我增殖,多向分化的能力,能分化成一些具有组织特性的细胞.采用磁珠分离法,从脐带血和骨髓中分离得到CD34+细胞. CD34+细胞+GM-CSF+IL-4等不同细胞因子组合,诱导形成DC.,(1

17、)诱导脐血CD34+干细胞成DC并扩增,利用磁珠分离脐血CD34+干细胞 (纯化的CD34+细胞为圆形的 非粘附细胞) 在GM - CSF、IL - 6、干细胞生长因子的共同诱导 下,生成三系共同组成的集落,一是非粘附的粒细胞,二是牢 固粘附的单核- 巨噬细胞,三是松散粘附的圆形细胞 洗涤去除粒细胞,余下的两类细胞在GM - CSF作用下继续培养,并经再次洗涤去除粒细胞后,获得粘附的单核-巨噬细胞(用吸管冲洗不易脱落)和松散粘附的圆形细胞团块,后者极易脱落 收集上述细胞团块并用GM - CSF和TNF - 培养24h,即 获得DCs,(2)诱导骨髓CD34+干细胞成DC并扩增,磁珠分离骨髓CD

18、34+细胞,经纯化获得的CD34+干细胞 用含GM - CSF、TNF - 等不同组合因子的RPM I1640 完全培养基或IMDM 培养基于37、5%CO2 温箱中培养 12 14天扩增出大量典型的DCs,DC的分离诱导培养过程有很多影响因素，如利用无血清培养基、MCM（单核细胞条件培养液）、MCM mimic（模拟单核细胞条件培养液：IL-1 10ng/ml，PGE2 1ug/ml，IL-6 1000U/ml及TNF- 10ng/ml）、以人AB血清代替FBS，以5%人AB型血浆代替完全1640培养液等。 最常见的是细胞因子的浓度，各实验室方法不同，浓度各异。从经济学角度考虑，国内一般采取

19、半量换液，再补充半量细胞因子。在实际操作中，应结合实际情况，综合考虑。,二.DC的鉴定 1.形态学观察,第四天 集落 第七天,DC和淋巴细胞,2.DC表型检测 DC尚未发现特征性的表面标志。对DC的鉴定除了在细胞形态上加以区别外，常用细胞表面标志组合等进行鉴别。 常见的DC表面标志有MHC-I、MHC-、CD1a、CD11c、ICAM-1、CD58 、CD40、CD44、CD83、CD80、CD86、整合素（1、2）、DC-SIGN、FcR、C3bR及各种趋化因子受体等。,目前一般用CD1a阳性细胞的多少来反映组织中DC的数量,用CD83表达的水平来反映DC的成熟度。 现在公认CD83是成熟D

20、C所特有膜标志分子。CD83是大分子量的跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员,由胞外、跨膜和胞内区组成。目前CD83的功能还不很清楚,但其表达方式和结构特点提示它可能在抗原提呈和细胞间反应中有重要功能。,协同刺激分子,在APC和T细胞间可传导共刺激信号的分子对很多,B7 /CD28、CTLA4是其中最重要的分子对。 B7 表达于活化B细胞、DC、巨噬细胞和活化T细胞表面,B7 家族属于免疫球蛋白超家族,包括B7 - 1 (CD80 ) 、B7 - 2 (CD86 )和B7 - 3三个成员。,CD40是DC表达的另一种协同刺激分子,表达于B细胞、DC、上皮细胞、造血前体细胞和某些肿瘤细胞表面,是

21、TNF -受体超家族成员。 CD40L主要表达在活化T细胞表面,是一种分子量为39KD的型跨膜糖蛋白,因此又叫做gp39,属于TNF -超家族成员,CD11a也是DC上一个重要协同刺激分子, CD11a可与配体CD54、CD102和CD50 (位于T细胞表面)结合提供共刺激信号,从而活化T细胞而发挥免疫功能,三.DC的功能检测 1.DC的群体内吞能力测定 未成熟DC以摄取抗原为主要功能,动态检测DC的内吞能力,可以反映其成熟状态.,HRP法:将培养0、5、8d的DC用PBS悬浮为5106/ml，加入离心管，500ul/管，在管中加入100ul辣根过氧化物酶溶液（10mg/ml），于37，5%C

22、O2培养箱中孵育45min，阴性对照于4孵育45min，用预冷的PBS洗涤两次，细胞沉淀中加入100ul 10% Triton-X100裂解细胞，加入TMB底物，37显色10min，2M H2SO4终止后450nm测A值，结果以3孔均值表示，代表DC的群体内吞能力。,FITC-DX法:将培养0、5、8d的DC用PBS悬浮为5106/ml，加入培养板，100ul/孔，在各孔中加入含FITC-DX（终浓度为1mg/ml）的完全RPMI-1640培养液，总体积2ml，于37，5%CO2培养箱中孵育45min，阴性对照于4孵育45min，用预冷的PBS洗涤两次，立即用流式细胞仪检测，荧光强度高于对照表

23、示DC对FITC-DX有摄入能力。,用以上两种方法检测DC内吞能力，可以发现随着培养天数增加，吞噬能力逐渐减弱，说明DC的功能逐渐转向对抗原的提呈。,2.MLR:同种异体混合淋巴细胞反应 两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLA类抗原中D和DP抗原不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此为双向混合淋巴细胞培养(two way MLC); 若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C (mytomycine C)处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养(one way MLC)。,T淋巴细胞增殖试验,原理：,淋巴细胞,DNA

24、合成,分化,母细胞,刺激物,细胞变大,细胞浆扩大,空泡,核仁明显,核染色质疏松,制备刺激细胞：将培养0、5、8d的DC调整为1106/ml，加入丝裂霉素25ug/ml，37，30min处理并充分洗涤，再调整细胞浓度为10104/ml、3104/ml、1104/ml。也可用放射线照射法制备刺激细胞。,制备效应细胞：按上述方法分离同种异体来源的PBMC，利用T细胞分离柱分离出T细胞，调整细胞浓度为1106/ml。,MTT法或3HTdR掺入法检测T细胞增殖的程度 少量DC即可强烈激发T细胞的增殖，并且随着DC浓度的增加，刺激作用逐渐增强，即DC浓度与其刺激淋巴细胞增殖功能成正比 .,3.DC疫苗诱导

25、的特异性CTL杀伤作用检测 以肿瘤细胞为基础的DC疫苗主要有:肿瘤细胞抗原肽DC疫苗、肿瘤细胞溶解物DC疫苗、凋亡的肿瘤细胞DC疫苗和肿瘤细胞与DC融合的杂交疫苗.,以T细胞和DC疫苗共同孵育24小时后,加入肿瘤细胞作为靶细胞,以MTT法或LDH释放法检测CTL的杀伤效应.,4.DC分泌细胞因子的检测 收集DC培养上清，按照ELISA试剂盒操作说明检测细胞因子的浓度。 通过检测其分泌细胞因子，了解其功能。,第三节 吞噬细胞分离及检测,大吞噬细胞:单核细胞和巨噬细胞 小吞噬细胞:中性粒细胞,吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。,一.中性粒细胞(多形

26、核白细胞) 急性炎症反应中重要参与细胞,在免疫应答过程中发挥作用,是构成机体第一道免疫防线的重要成分. 生物学特性和功能:趋化性,吞噬杀菌作用,抗病毒作用,免疫调节作用,(一)中性粒细胞的分离,多聚葡萄糖法 右旋糖酐法 自然沉降法,(二)中性粒细胞功能的检测,细胞趋化功能的检测 吞噬和杀菌功能的检测,(一) 细胞运动功能趋化功能检测,1.原理：,趋化因子受体,阿米巴样定向移动,穿过毛细血管内皮细胞间隙,到达炎症病灶,发挥功能.,2. 方法学：,滤膜小室法（Boyden 小室法）,采用特殊的小盒装置，盒中以一片35m孔径的微孔滤膜将盒分为上下两小室。上室加受检的白细胞悬液；下室加细菌菌体或其产物

27、、酵母菌活化的血清等趋化因子。置37温育数小时。上室中的中性粒细胞因受下室内趋化因子的招引，使细胞由滤膜微孔进入滤膜内，最后取滤膜，经固定、干燥、着染、脱色等步骤，将透明后的滤膜置油镜下检测细胞在膜内通过的距离，求其趋化单位。,琼脂糖平板法,体内实验(皮肤窗法) 在前臂屈侧中央按直径3mm大小,搔破皮肤,用无菌盖玻片压紧固定,定时观察中性粒细胞的变化. 每隔一定时间取样一次,染色观察,确定中性粒细胞开始聚集的时间,聚集程度和细胞形态变化.,(二)吞噬和杀菌功能测定,1显微镜检查法：,12滴全血等量菌液 3730min 推片、甲醇固定、碱性美蓝染色、计数,%,白细胞杀菌功能检测的检测,溶细胞法

28、NBT还原法 化学发光法,白细胞菌液,37培养,定时取定量菌液培养,计算菌落数,溶细胞法,%,中性粒细胞杀菌 耗能 代谢 生成H+,四氮唑蓝(淡黄色),甲簪(蓝黑色),原理,操作,四氮唑蓝(NBT)还原试验,抗凝血+NBT应用液 温育 推片 瑞士复染 镜下观察,化学发光法,中性粒细胞在吞噬经调理的金黄色葡萄球菌过程中，伴有化学发光的产生，故可用化学发光仪测定中性粒细胞的吞噬功能及其代谢活性。 实验证明全血化学发光试验可同时获得两种信息，即中性粒细胞的吞噬功能、代谢活性及受检血清的调理功能。,由于中性粒细胞的氧代谢活性与对细胞的吞噬率密切相关，杀菌能力与发光强度相平行，因此化学发光法可检测细胞杀

29、菌功能。 吞噬细胞化学发光测定法可用以研究中性粒细胞的吞噬功能，代谢活性和血清调理功能，它可在生理温度和中性环境下测定，能较好地反映生理条件下吞噬细胞的功能，具有准确灵敏、样品用量少，简便快速等优点。其敏感性高于NBT还原试验。,化学发光法: 敏感,样品用量少,操作简便快速,发光,中性粒细胞杀菌 NADPH氧化酶激活 过氧化离子,SOD,H2O2,髓过氧化物酶,鲁米诺,次氯酸和卤化物,杀菌,杀菌,被激活,二、单核巨噬细胞功能检测,吞噬与 杀伤功能,抗原提呈作用 免疫调节 抗肿瘤作用,骨 髓,血 液,组 织,多能干细胞,髓样干细胞,单核母细胞,前单核细胞,单核细胞,单核细胞,巨噬细胞 结缔组织：

30、组织细胞 肺：肺泡巨噬细胞 肝：枯否细胞 脾与淋巴结：游走与固定巨噬细胞 浆膜腔：胸、腹腔巨噬细胞 神经组织：小胶质细胞 骨：破骨细胞 关节：滑膜A型细胞,单核吞噬细胞的来源和分布,1.趋化功能实验 Boyden小室法,2.MTT法检测人脾脏巨噬细胞细胞毒效应 人淋巴细胞+PHA刺激后取上清为巨噬细胞激活因子 脾脏中分离单核细胞,黏附法获得人脾巨噬细胞 MTT法:脾巨噬细胞加刺激因子培养,加入靶细胞,用MTT法检测结果.,3.吞噬功能测定 1)皮泡法,【操作方法】 （1）取1cm2大小的滤纸片2张，蘸满斑蟊酊，置于一侧前臂皮肤上，在滤纸片上压一块稍大的塑料片，上面再敷以清洁纱布，固定； （2）

31、45h后，取下塑料片和滤纸，可见局部皮肤发红，表皮开始松动，用一拱型塑料盖将局部罩好，固定包扎以防止开始形成的水泡破裂； （3）48h后，局部皮肤即形成一个完整的水泡。将皮肤消毒后，用无菌注射器小心抽取皮泡内渗出液，盛于无菌试管中； （4）局部用消毒纱布敷盖，2d后取下纱布。此法病人无疼痛及任何不良反应。 斑蟊酊诱发的皮肤炎性渗出液有多有少，大多在12ml，最多的可达8ml。皮泡液中含M数平均为3040，最多可达80；,（5）取皮泡渗出液0.5ml ,加CRBC悬液0.01ml（CRBC数约为56106）； （6)混匀，置37水浴中30min，（每隔10min轻轻摇动一次）。1000r/min

32、离心5min，弃上清，留少许液体将细胞充分混匀，涂片，甲醇固定，Giemsa染色，油镜下观察并计数100200个M；,【结果分析】 吞噬细胞：即100个M中吞噬有CRBC的细胞数。 吞噬指数：将100个M所吞噬CRBC的总和除以100，所得每个M吞噬CRBC的平均数，即吞噬指数。 此外，在计数时，应同时注意CRBC被消化的程度分为4级: 级:未消化胞质浅红或浅黄带绿色，胞核浅紫红色。 级:轻度消化胞质浅黄绿色；核固缩，染成紫蓝色。 级:重度消化胞质淡染，胞核呈浅灰黄色。 级:完全消化M内只见形状似RBC大小的空泡，边缘整齐，胞核隐约可见。,(2)炭粒廓清试验,正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测